《Frontiers in Microbiology》：Evaluation of whole genome sequencing protocols and target-capture panels for detection of respiratory viruses in clinical specimens
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呼吸道病毒是全球发病率和死亡率的主要贡献因素。当病毒突变导致传统诊断检测效能下降时，识别病例和追踪传播变得困难。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）较传统诊断具有优势，因其可检测携带新突变的病毒。本研究评估了ePlex、快速多
呼吸道病毒是全球发病率和死亡率的主要贡献因素。当病毒突变导致传统诊断检测效能下降时，识别病例和追踪传播变得困难。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）较传统诊断具有优势，因其可检测携带新突变的病毒。本研究评估了ePlex、快速多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测（rapid multiplex PCR assay，RMPA）、内部实时逆转录PCR检测（real-time reverse transcription PCR，RT-qPCR）和WGS在临床标本中检测呼吸道病毒感染的表现。研究人员制备了61个序列文库，并对2021年采集的鼻咽拭子进行诱饵富集（bait enrichment）；这些拭子经ePlex检测为SARS-CoV-2阴性，但呼吸道病毒共感染（co-infections）阳性。内部生物信息学流程使宏基因组分析（metagenomic analysis）方法得以与ePlex和RT-qPCR进行比较。在多数拭子中，WGS（平均基因组回收率：85.9%）或RT-qPCR检测到呼吸道病毒，且与ePlex结果一致，但表现为单一病毒而非共感染。WGS最常回收呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial viruses，80%）和偏肺病毒（metapneumoviruses，70%）。本研究表明WGS和诱饵捕获（bait capture）在从有限临床材料中解析呼吸道病原体基因组方面的能力。在此情形下检出单一病毒而非共感染，可能提示诱饵捕获技术的靶向性质或病毒在诱饵杂交（bait hybridization）过程中的竞争。检出的呼吸道合胞病毒数量（16/20）可能归因于COVID-19大流行中非药物干预（non-pharmaceutical interventions）解除后检测到的活动高峰。
论文主体解读如下：
研究背景方面，呼吸道病毒是21世纪重大病毒暴发的重要病原，且地方性病毒持续造成疾病负担，因此快速、可靠的分子诊断对早期发现感染者、支持传播控制措施和公共卫生应对具有重要意义。实时PCR（qPCR）是感染性疾病分子诊断的常用方法，但其灵敏度与特异性可受样本质量、检测设计、流程执行和数据解释影响。快速多重PCR检测（rapid multiplex PCR assay，RMPA）具有标准化和用户友好特点，但多数平台提供定性结果，且因检测化学常为专有，假阴性或假阳性结果调查具有挑战性。全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）可检测携带新突变的病毒，并可通过RNA/DNA诱饵技术（bait technology）富集目标病原；SARS-CoV-2大流行初期，英国通过COG-UK扩大WGS应用，以高分辨率描绘传播模式和变异出现。已有研究比较RMPA与qPCR，部分研究观察到临床样本病毒循环阈值（cycle threshold，Ct）高于30时灵敏度下降；也有研究比较BioFire Pneumonia Panel RMPA与WGS，但样本分别为支气管肺泡灌洗液和鼻咽拭子。据作者所述，尚无文献描述WGS、内部RT-qPCR与RMPA在鼻咽拭子中的比较。因此，研究人员评估三种文库制备和诱饵捕获方案对六种呼吸道病原体的效率，将最敏感方案用于经ePlex筛选为SARS-CoV-
2阴性但呼吸道病毒共感染阳性的鼻咽拭子，并以宏基因组生物信息学分析和多重RT-qPCR评估其与ePlex的一致性。
关键技术方法方面，研究人员比较SST-RVOP、SST-RVRP与TLP-RVRP三种文库制备与诱饵捕获组合，并将筛选后的WGS流程用于2021年采集的61份鼻咽拭子（病毒运输培养基保存，经ePlex筛选为SARS-CoV-
2阴性且呼吸道病毒共感染阳性）。同步采用ePlex RMPA和内部半定量RT-qPCR。生信流程包括去人源、深度标准化、质控、metaSPAdes组装、BLASTN比对RefSeq及读段比对统计；统计采用配对Wilcoxon检验、Bonferroni校正、阳性符合率（positive percent agreement，PPA）、阴性符合率（negative percent agreement，NPA）与Cohen’s kappa（κ）。
研究结果方面，3.1 Evaluation of library preparation kit and bait enrichment strategy：在未稀释提取物中，SST/RVOP与SST/RVRP、SST/RVOP与TLP/RVRP、SST/RVRP与TLP/RVRP之间分别观察到显著中位倍数变化7.4、9.4和1.4；1:10提取物中，SST/RVOP与SST/RVRP增加1.9，SST/RVRP与TLP/RVRP下降2.5；1:100提取物变化与未稀释提取物相似，分别下降8.5、71.5和6.8。稀释提取物中使用TLP时中位比对读段数总是低于SST；SST/RVRP或TLP/RVRP的中位值范围更明显。该优化实验提示高浓度时SST/RVRP或TLP/RVRP表现优于SST/RVOP，而低浓度时趋势反转，SST/RVOP读段回收在不同稀释点间变异最小。
3.2 Identifying swab constituent viruses：RT-qPCR未检测bocavirus和parainfluenza virus；RT-qPCR和WGS的病毒检测plexity最高为三种，而ePlex可检测四种不同病毒。ePlex判定为共感染的拭子中，双病毒共感染占63.9%。RT-qPCR和WGS分别在14.8%和26.2%的拭子中未检出病毒；二者最常检出单一病毒，分别占57.4%和60.7%。与ePlex相比，RT-qPCR和WGS检出同一拭子中多种不同病毒的比例较低，分别为27.9%和13.1%。多病毒检出样本中，ePlex和RT-qPCR共检出以enterovirus最常见，而WGS共检出以parainfluenza virus为主。该部分表明ePlex每份拭子检出病毒数更多，而RT-qPCR和WGS更常检出单一病毒。
3.3 Comparisons between the workflows：ePlex产生定性结果，WGS和RT-qPCR提供定量指标以评估诊断流程一致性。ePlex和RT-qPCR检出49种WGS未检出的病毒，其Ct值范围为23.4至39.9，近三分之二为enterovirus。三种流程共有40例病毒检出结果一致，其中多数靶向读段（on target reads，OTRs）低于50%且Ct值低于30（27/40）；半数回收近完整基因组，多为coronavirus或RSV。Ct值超过30时，若排除enterovirus，半数实例在OTRs低于1%时仍回收至少50%基因组。WGS检出enterovirus的4例中富集表现不佳，与相似Ct值的其他病毒相比基因组完整性下降至少25%。parainfluenza virus和bocavirus多次检出、metapneumovirus单次检出未被RT-qPCR检测或未测；bocavirus的OTRs高，而parainfluenza virus和该metapneumovirus较低，但多数仍回收至少一半基因组。ePlex可分型季节性coronavirus、influenza、parainfluenza和RSV，且RT-qPCR或WGS检出的每种病毒均被ePlex检出，分型完全一致。WGS或RT-qPCR与ePlex比较时，所有受试病毒PPA为100%；总体符合率（overall percent agreement，OPA）最高为metapneumovirus（70.00%或60.00%）和RSV（80.00%或85.00%），最低为adenovirus与enterovirus（12.50%或31.25%；11.76%或32.35%）。WGS与RT-qPCR比较时，OPA最高为metapneumovirus（90.00%）和RSV（95.00%），8种病毒中7种OPA高于PPA。所有病毒中，RT-qPCR对WGS的OPA为73.70%，高于RT-qPCR对ePlex的52.95%和WGS对ePlex的37.04%。RT-qPCR与WGS病毒检测呈中度一致（κ=0.47，p<0.05）；adenovirus为中度一致（κ=0.48），coronavirus（κ=0.65）、RSV（κ=0.83）和metapneumovirus（κ=0.78）为高度一致。该部分表明RT-qPCR与WGS一致性高于二者分别与ePlex的一致性，WGS对adenovirus和enterovirus回收较差。
3.4 WGS workflow genome recovery and identifying swab co-infections：将各病毒类型基因组回收率与所有病毒序列回收率比较，bocavirus、parainfluenza virus和RSV基因组回收高于平均值，coronavirus和metapneumovirus接近平均值，adenovirus和enterovirus捕获低于平均值；enterovirus基因组回收显著低于WGS检出的所有病毒（p<0.05）。在21份RT-qPCR或WGS检出多种病毒且与ePlex一致的拭子中，71.4%的拭子单一病毒基因组回收超过70%；按研究设定的操作标准，2份拭子满足两项标准，分别为RSV-A与metapneumovirus，或enterovirus、parainfluenza virus与RSV-B。该部分表明捕获性能因病毒类型而异，保守标准下共感染判定较少。
讨论部分总结：研究人员开发了优化的诱饵富集流程并结合无偏宏基因组分析。SST/RVRP或TLP/RVRP在高病毒核酸浓度样本中优于SST/RVOP，但病毒核酸量降低时趋势反转，SST/RVOP读段回收在所有稀释点间变异最小。方案差异包括SST适用于小片段RNA输入而无片段化步骤、PCR加接头可增加低丰度核酸代表性、SST包含核糖体RNA去除步骤，以及RVRP采用CATCH设计而RVOP诱饵数较少（41,047对约7,800），可能因错配耐受解释低核酸浓度下回收更高。研究局限包括资源限制下单实验同时捕获DNA和RNA病毒、未进行DNase消化和宿主或细菌污染物去除；初始评估使用组织培养病毒核酸稀释，鼻咽拭子与培养体系组成差异可能解释adenovirus序列回收差异；DNA病毒回收率低于RNA病毒，可能与SST逆转录酶的DNA依赖DNA聚合酶活性或表达病毒RNA检测有关。ePlex每份拭子检出病毒最多；WGS和RT-qPCR以单一病毒最常见；WGS单病毒优势可能由优势病原在文库制备和捕获中竞争试剂、掩盖其他病毒所致。RMPA检出多种病毒后经诱饵富集和测序仅鉴定单一病毒并不罕见；ePlex检出而RT-qPCR和WGS未检出，使临床感染或携带状态存在不确定性。研究采用保守共感染标准，2/61份拭子符合，其中一份为enterovirus、RSV和parainfluenza virus，另一份为RSV和metapneumovirus；标准基于不同Ct值下组织培养感染成功的研究。WGS回收近完整基因组最多者为RSV（14/16），可能与RSV基因组多样性较低或采样时间 coincided with 北半球RSV活动高峰有关。Enterovirus捕获性能明显较差，WGS检出率12%显著低于RT-qPCR的74%，即使Ct值低于30也少回收近完整基因组；这与既往报道的enterovirus序列捕获效率较低一致，可能反映RVOP探针集对该病毒遗传多样性覆盖不足。一个例外是WGS回收不完整metapneumovirus基因组而RT-qPCR未检出，其覆盖缺口827至922位与引物和探针结合位点重叠，可能贡献RT-qPCR信号丢失；这显示序列捕获用于监测不受病毒多样性限制，并可指导序列特异性诊断检测设计，后续需设计靶向该区域侧翼保守区的引物并以Sanger测序确认。总体上，RT-qPCR对WGS的OPA高于RT-qPCR对ePlex或WGS对ePlex，Cohen’s kappa显示中度一致；WGS对ePlex的OPA最低，与adenovirus和enterovirus基因组回收差有关；RT-qPCR对WGS的PPA低于OPA，可能提示WGS相对RT-qPCR灵敏度较低，并与高Ct值信号丢失相关（12/35例Ct值<30）。研究局限还包括样本可得性导致临床样本集较小且可能偏倚，无法计算ePlex对WGS或RT-qPCR的NPA；冻融循环可能影响不同病毒，导致完整衣壳丢失和病毒基因组降解，从而影响病毒核酸回收。
研究结论翻译：下一代测序（next-generation sequencing，NGS）平台可及性不断提高，扩展了呼吸道感染宏基因组研究的机遇。WGS提供灵活且可扩展的方法，较少受病毒遗传多样性限制，并可支持监测和诊断开发。随着测序技术日益自动化和可及，基于捕获的宏基因组测序可能在呼吸道病毒诊断和公共卫生监测中发挥不断扩大作用。
