《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Integrative transcriptomics reveals an ECM/PNN-high astrocyte state and cross-tissue biomarkers in major depressive disorder
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背景：重度抑郁障碍（major depressive disorder, MDD）与神经可塑性受损相关，而细胞外基质（extracellular matrix, ECM）和神经周围网络（perineuronal nets, PNNs）是突触稳定性和细胞外稳态的
背景：重度抑郁障碍（major depressive disorder, MDD）与神经可塑性受损相关，而细胞外基质（extracellular matrix, ECM）和神经周围网络（perineuronal nets, PNNs）是突触稳定性和细胞外稳态的重要调控因子。然而，MDD中与ECM/PNN改变相关的细胞状态和分子特征仍知之甚少。方法：研究人员整合了bulk转录组和单细胞转录组数据集，以表征MDD中ECM/PNN相关的细胞状态。使用多种ECM/PNN评分方法评估星形胶质细胞群体，并将疾病相关的转录变化与星形胶质细胞共表达网络整合，以识别候选分子特征。进一步采用功能富集、细胞间通讯、假时间分析和计算机模拟扰动分析探究其生物学背景。最后，使用皮质酮（corticosterone, CORT）处理的HT22细胞作为糖皮质激素诱导的神经元应激范式，评估所识别基因的应激反应性表达。结果：在星形胶质细胞亚群中，Cluster2表现出总体较高的ECM和PNN特征评分。将Cluster2相关共表达模块与MDD相关差异表达基因整合，识别出28个重叠基因，其中ACSL6、FIP1L1和ZNF709被优先作为跨组织候选特征，在脑和外周血数据集中呈现一致的表达趋势。ACSL6和ZNF709在MDD中下调，而FIP1L1上调。功能分析将这三个基因与代谢及氨基酸相关过程相关联，而FIP1L1还显示出与细胞粘附、细胞骨架组织和突触信号传导的额外关联。细胞通讯和假时间分析进一步提示，在推断的星形胶质细胞状态转变中，细胞间信号传导发生改变且ECM/PNN活性增加。在CORT处理的HT22细胞中，ACSL6和ZNF709显著降低，而FIP1L1升高，与转录组观察结果一致。结论：这些发现识别了MDD中一种ECM/PNN高星形胶质细胞状态及三个相关的跨组织分子特征。其中，FIP1L1成为与粘附和突触可塑性相关程序关联的功能优先候选基因。这些基因的应激反应性表达为其与糖皮质激素相关神经元应激的相关性提供了额外实验支持，并支持以星形胶质细胞为中心的ECM/PNN工作模型，以供进一步机制研究。
重度抑郁障碍（major depressive disorder, MDD）以持续情绪低落和快感缺失为核心症状，常伴认知损害、睡眠和食欲改变、精神运动异常及自杀风险增高，其发病机制涉及单胺信号失调、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能障碍、神经免疫失调、胶质细胞功能障碍和突触可塑性受损等多重病理过程。当前抗抑郁治疗存在缓解率不足和复发风险较高的问题，且缺乏能客观反映潜在病理改变并适用于临床的分子生物标志物。细胞外基质（extracellular matrix, ECM）是调控神经可塑性的关键组分，神经周围网络（perineuronal nets, PNNs）是中枢神经系统中高度特化的ECM结构，在稳定突触连接、调节发育关键期可塑性和维持兴奋/抑制平衡中发挥重要作用。慢性应激可诱导脑内ECM/PNN重塑，而星形胶质细胞参与ECM组分合成和PNN动态调控。然而，MDD中ECM/PNN相关星形胶质细胞状态和分子特征尚不清楚。研究人员假设MDD可能存在以ECM/PNN特征改变为标志的星形胶质细胞状态，并整合bulk转录组与单细胞转录组数据对该假设进行验证，以期为理解MDD神经可塑性异常机制和筛选候选生物标志物提供新线索。
研究人员从GEO数据库获取训练集GSE54564（人脑杏仁核，21例MDD和21例对照）、验证集GSE76826（人外周血，20例MDD和12例对照），并合并两个额叶皮层单细胞RNA测序数据集（GSE144136，17例MDD和17例对照；GSE213982，20例MDD和18例对照）进行后续分析。分析流程包括：Seurat流程进行质控、降维和无监督聚类；irGSEA包中五种算法（AUCell、UCell、singscore、ssGSEA和AddModuleScore）计算ECM/PNN特征评分；高维加权基因共表达网络分析（high-dimensional weighted gene co-expression network analysis, hdWGCNA）构建共表达模块；limma鉴定差异表达基因；LASSO和SVM-RFE两种机器学习算法筛选特征基因；基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）评估生物学通路；CellChat分析细胞间通讯；Monocle进行假时间轨迹分析；Geneformer进行虚拟扰动预测。体外采用20 μM皮质酮（CORT）处理HT22细胞24 h建立糖皮质激素诱导神经元应激模型，并通过CCK-8和RT-qPCR进行验证。
**星形胶质细胞Cluster2代表MDD中具有高ECM和PNN特征的细胞簇**：质控后保留212,061个单细胞，注释出少突胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质前体细胞、小胶质细胞、内皮细胞、兴奋性神经元和抑制性神经元7种细胞类型。星形胶质细胞重聚类为4个亚群（Cluster0–3）。五种评分算法一致显示Cluster2具有最高的ECM和PNN特征评分，被确定为主要研究的目标细胞簇。
**与星形胶质细胞Cluster2相关的生物学通路**：hdWGCNA共表达网络分析识别出与ECM/PNN显著相关的brown、turquoise和yellow三个关键模块，共包含766个关键模块基因。训练集差异表达分析鉴定出982个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。将关键模块基因与DEGs取交集获得28个基因。GO富集分析显示这些基因参与神经元投射引导、突触相关ECM和谷氨酸受体结合等过程；KEGG富集分析得到产热等23条通路，并与钙稳态介导的调节功能相关联。
**与星形胶质细胞Cluster2相关的三个生物标志物**：LASSO和SVM-RFE分别识别出13个和24个特征基因，交集获得13个共同特征基因。结合训练集和验证集分析，ACSL6、FIP1L1和ZNF709在MDD与对照组间表达差异显著且趋势一致，被确定为跨组织生物标志物。其中，ACSL6和ZNF709在MDD中显著下调，FIP1L1显著上调。表达异质性分析显示，三个基因在少突胶质细胞、兴奋性神经元和抑制性神经元中均存在显著表达差异。
**ACSL6、FIP1L1和ZNF709相关的失调生物学程序**：GSEA结果显示，ACSL6富集于氧化应激反应和能量代谢调节相关通路；FIP1L1富集于细胞命运相关信号转导，并负富集线粒体能量代谢通路；ZNF709在两个数据库中均负富集NOTCH信号通路，其KEGG富集集中于氨基酸代谢、鞘脂代谢和核糖体相关功能。综合三者结果提示MDD中存在能量代谢和细胞命运调控通路的广泛失调。
**细胞间通讯改变和生物标志物扰动的预测功能结果**：细胞通讯分析显示，MDD组细胞间相互作用数量和整体通讯强度较对照组增加，NRXN等通路信号增强。假时间分析显示ECM和PNN特征评分沿推断的星形胶质细胞状态转变轨迹逐渐增加。基于Geneformer的虚拟敲除预测显示，三个生物标志物敲除后共享的富集项包括细胞前沿（CC）和L-谷氨酸及酸性氨基酸跨膜转运蛋白活性（MF）；FIP1L1敲除后独特富集细胞粘附、细胞骨架和突触相关通路，提示其可能额外参与粘附和突触信号通路相关程序。上述扰动结果为计算预测，尚需实验验证。
**糖皮质激素诱导神经元应激下生物标志物的应激反应性mRNA变化**：CCK-8实验确定20 μM CORT处理24 h为适宜建模浓度。RT-qPCR结果显示，与对照组相比，CORT模型组ZNF709和ACSL6 mRNA水平显著降低，FIP1L1 mRNA水平显著升高，与转录组测序观察到的表达趋势一致。
讨论部分综合认为，星形胶质细胞Cluster2可能通过维持ECM/PNN稳态和胶质-神经元串扰影响突触稳定性、兴奋/抑制平衡和网络可塑性，从而参与MDD病理过程。三个生物标志物分别涉及膜脂代谢（ACSL6）、RNA加工（FIP1L1）和转录调控（ZNF709），表明MDD相关ECM/PNN异常可能源于脂质稳态、转录后调控和转录调控的协同失调。其中，FIP1L1因功能富集和虚拟扰动结果均指向细胞粘附、细胞骨架和突触可塑性相关通路，被确定为功能优先的候选标志物，其上调可能通过扰动星形胶质细胞转录后调控网络而影响ECM/PNN稳态和星形胶质细胞-神经元相互作用。研究结论为：本研究识别了MDD中一种ECM-PNN高星形胶质细胞转录状态，并表征了与该状态相关的三个跨组织生物标志物（ACSL6、FIP1L1和ZNF709）。计算分析提示这些基因参与代谢过程，FIP1L1还表现出与细胞粘附和突触可塑性相关程序的预测关联。糖皮质激素诱导的神经元应激实验证实了三个生物标志物的应激反应性mRNA表达变化。上述发现提出了星形胶质细胞ECM-PNN重塑参与MDD发病的生物学合理工作模型，仍需要进一步的体外和体内功能实验验证该机制假说。
