《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Defining glioma ecosystem states with AI-driven single-cell and spatial multi-omics: immune-niche reprogramming and therapeutic vulnerabilities
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目的： 利用单细胞核、空间、组织及机器学习分析，定义具有临床意义的胶质瘤生态系统状态（恶性肿瘤程序与微环境生态位的复发性空间构型），并识别依赖于免疫生态位的治疗脆弱性。
方法： 将公共多组学数据集与机构内部12例肿瘤的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）、
目的： 利用单细胞核、空间、组织及机器学习分析，定义具有临床意义的胶质瘤生态系统状态（恶性肿瘤程序与微环境生态位的复发性空间构型），并识别依赖于免疫生态位的治疗脆弱性。
方法： 将公共多组学数据集与机构内部12例肿瘤的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）、6例IDH野生型胶质母细胞瘤（GBM）的空间转录组学（ST）、138例福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）病例的多重免疫荧光（mIF）以及胶质瘤-巨噬细胞共培养实验相结合。
结果： 研究识别出三种生态系统状态。低氧髓系-间充质状态表现出最高的间充质样（MES-like）、低氧、SPP1/APOE髓系及替莫唑胺（TMZ）耐药评分，最低的CD8+ T细胞密度，以及最短的肿瘤-髓系细胞距离。在96例IDH野生型胶质母细胞瘤中，该状态在校正主要临床及分子协变量后，独立预测较短的无进展生存期（HR 2.19，95% CI 1.22–3.92）和总生存期（HR 2.07，95% CI 1.12–3.81）。在巨噬细胞条件培养下，地法替尼（Defactinib）联合替莫唑胺分别使细胞活力、集落形成和迁移能力降低56.0%、61.3%和57.8%。
结论： 空间组织的肿瘤-免疫生态系统可提供预后信息，并凸显胶质母细胞瘤中潜在可靶向的SPP1–CD44/FAK–SRC信号通路，作为个体化治疗分层策略的候选靶点。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
成人弥漫性胶质瘤是中枢神经系统内生物学异质性最强、临床挑战最大的肿瘤之一。尽管手术技术、放疗、以替莫唑胺为基础的化疗及分子诊断不断进步，IDH野生型胶质母细胞瘤患者的预后仍然极差。现行基于IDH突变、1p/19q共缺失、MGMT启动子甲基化、EGFR扩增、TERT启动子突变等分子标志物的整合分类体系显著提升了诊断准确性和预后分层能力，但这些标志物无法完全解释胶质母细胞瘤中观察到的深度瘤内异质性、免疫逃逸、空间侵袭、治疗耐药及早期复发等复杂现象。
胶质瘤的进展并非仅由恶性细胞驱动，而是作为一个由肿瘤细胞、驻留小胶质细胞、浸润巨噬细胞、内皮细胞、周细胞、T细胞、基质样成分及区域特异性细胞外基质结构共同组成的复杂生态系统而演进。在这一生态系统中，恶性细胞可占据多种转录状态，包括星形胶质细胞样（AC-like）、少突胶质前体细胞样（OPC-like）、神经前体细胞样（NPC-like）和间充质样（MES-like）程序。这些状态并非固定不变的实体，而是动态且部分重叠的表型，可响应低氧、炎症、治疗应激及局部微环境压力而发生转变。其中，间充质样转变反复与低氧应激、髓系浸润、侵袭行为及治疗耐药相关联。
胶质瘤的免疫微环境以髓系细胞为主，包括脑驻留小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞。尽管这些细胞在胶质母细胞瘤中数量丰富，但往往无法建立有效的抗肿瘤免疫，反而可能支持肿瘤生长、细胞外基质重塑、血管生成及T细胞排斥。传统M1/M2极化模型不足以描述这种多样性。近期单细胞和空间研究提示，SPP1或APOE相关的巨噬细胞样程序可能在空间上靠近侵袭性肿瘤细胞状态，形成免疫抑制性生态位。
单细胞和单细胞核RNA测序虽能高分辨率刻画胶质瘤细胞组成和恶性状态多样性，但基于组织解离的方法必然丢失空间背景信息。空间转录组学通过保留组织学结构弥补了这一局限，但其数据需与单细胞参考图谱仔细整合。人工智能和可解释机器学习方法为整合这些多层次数据提供了实用策略，能够在患者层面定义兼具生物学可解释性和临床相关性的生态系统状态。
本研究旨在利用AI驱动的单细胞核和空间多组学系统性地绘制胶质瘤生态系统状态图谱，重点关注IDH野生型胶质母细胞瘤中的免疫生态位重编程与治疗脆弱性，通过整合公共多组学数据、机构内部单细胞核测序、空间转录组学、多重免疫荧光、可解释机器学习及胶质瘤细胞-巨噬细胞共培养实验，在不使用动物模型的条件下识别恶性及免疫细胞状态程序、定位高风险肿瘤-免疫生态位、在临床FFPE组织中验证生态系统状态，并优先筛选可实验验证的治疗脆弱性靶点。
二、研究设计与技术方法
研究人员采用无动物实验的转化研究设计，整合了多来源数据与多层次验证。公共多组学数据方面，纳入了10个公共单细胞/单细胞核数据集共1,184,362个细胞或细胞核、5个公共空间转录组队列共392,814个组织覆盖点、TCGA-GBM/TCGA-LGG共671例及CGGA共1,391例用于批量水平验证，以及DepMap、GDSC和PRISM药物敏感性与基因依赖性数据集用于药物靶点筛选。机构内部队列方面，前瞻性组学队列包含12例初治弥漫性胶质瘤（9例IDH野生型胶质母细胞瘤、2例IDH突变型星形细胞瘤、1例少突胶质细胞瘤），完成单细胞核RNA测序获得82,436个高质量细胞核；其中6例IDH野生型胶质母细胞瘤进行空间转录组学分析，获得21,384个组织覆盖点；回顾性验证队列包含138例FFPE弥漫性胶质瘤（含96例IDH野生型胶质母细胞瘤），贡献276个组织微阵列核心用于多重免疫荧光和临床验证。
关键技术方法包括：单细胞核RNA测序（snRNA-seq）用于细胞组成和恶性状态刻画；空间转录组学（ST）结合cell2location、RCTD和Tangram进行空间反卷积与生态位识别；多重免疫荧光（mIF）用于FFPE组织中的空间验证；CellChat和NicheNet推断肿瘤-免疫配体-受体互作；XGBoost机器学习分类器整合多维空间和转录组特征进行预后建模，结合SHAP实现生物学可解释性；体外胶质瘤细胞-巨噬细胞共培养模型用于功能验证。
三、研究结果
1. 队列构建与多组学工作流程
研究人员构建了功能分层的机构队列体系：前瞻性组学队列用于高分辨率细胞和空间图谱绘制，空间转录组学子集用于生态位定位，FFPE回顾性队列用于临床和空间验证。参考图谱解析出六个主要细胞区室和四种恶性程序（AC-like、OPC-like、NPC-like、MES-like），并识别出肿瘤核心、坏死旁低氧、血管周围、免疫富集、T细胞排斥和侵袭边缘六种解剖生态位。三种生态系统状态（ES1-ES3）中，ES3优先连接MES-like恶性细胞、SPP1/APOE相关髓系细胞、低氧生态位及SPP1–CD44、CCL2–CCR2和TGF-β信号通路。
2. 单细胞核转录组图谱定义细胞架构
整合UMAP分析解析出恶性细胞、小胶质细胞样细胞、单核细胞来源巨噬细胞样细胞、T/NK细胞、内皮细胞/周细胞及非恶性神经谱系细胞六大类群。恶性细胞状态呈连续分布，MES-like评分与低氧评分沿同一转录连续体增加，支持状态可塑性而非互斥的恶性亚型。单核细胞来源巨噬细胞样细胞在IDH野生型胶质母细胞瘤中占16.6%，显著高于IDH突变型星形细胞瘤（5.4%）和少突胶质细胞瘤（3.5%），总髓系细胞分别占27.4%、13.8%和8.7%，支持外周髓系细胞募集是侵袭性疾病的定义性特征。
3. 恶性状态可塑性与髓系免疫重编程定义生态系统状态
在FFPE队列中识别出三种可重复的生态系统状态。ES1（谱系限制性免疫冷状态，n=48）以高OPC/NPC-like评分、低MES-like和低氧评分、低SPP1/APOE髓系活性及最高CD8+ T细胞密度为特征。ES2（增殖性血管周围状态，n=42）表现出最高的细胞周期评分、CD31阳性血管密度和血管周围生态位评分。ES3（低氧髓系-间充质状态，n=48）全部为IDH野生型胶质母细胞瘤，具有最高的MES-like评分、低氧评分、CA9阳性面积、SPP1/APOE髓系评分和替莫唑胺耐药特征，同时SPP1阳性/CD68阳性髓系细胞密度最高、肿瘤-髓系距离最短、CD8+ T细胞密度最低且排斥距离最大。
4. 空间转录组学揭示解剖生态位
空间分析在IDH野生型胶质母细胞瘤中识别出六种空间组织区室。坏死旁低氧区域富集低氧、CA9、MES-like活性和SPP1–CD44信号；血管周围区域显示最大CD31相关活性；免疫富集区域显示强SPP1/APOE髓系活性和肿瘤-髓系邻近性；T细胞排斥区域CD8+ T细胞密度最低且排斥距离最大。MES-like恶性细胞和SPP1/APOE相关髓系细胞优先映射至坏死旁低氧和免疫富集生态位，CD8+ T细胞在低氧和MES-like高活性区域被空间耗竭。
5. 多重免疫荧光验证生态系统状态
多重免疫荧光在FFPE队列中验证了三种生态系统状态的空间组织。从ES1到ES3，CD44高肿瘤区、CA9高低氧区和SPP1阳性/CD68阳性髓系区室的相对贡献递增，而CD8+ T细胞区室递减。CD44阳性面积、CA9阳性面积、SPP1阳性/CD68阳性髓系密度、MES-like评分、低氧评分和生态系统风险评分呈正相关，CD8+ T细胞密度与高风险特征呈负相关。
6. 生态系统状态与临床结局关联
在96例IDH野生型胶质母细胞瘤亚组中，ES3在单变量分析中与ES1相比进展风险增加2.83倍。校正年龄、KPS评分、切除程度、MGMT启动子甲基化及标准放化疗完成情况后，ES3仍独立预测较短的无进展生存期（HR 2.19，95% CI 1.22–3.92，P=0.008）和总生存期（HR 2.07，95% CI 1.12–3.81，P=0.020）。连续生态系统风险评分在多变量校正后仍具独立预后价值（PFS HR 1.52，P=0.004；OS HR 1.47，P=0.015）。整合模型C-index为0.74，显著高于临床基线模型的0.65（P=0.014），12个月总生存时间依赖性AUC从0.67提升至0.78。
7. AI驱动的治疗脆弱性优先排序与体外功能验证
多证据整合排序显示，SPP1–CD44/FAK–SRC轴获得最高综合证据评分8.8，其次为CCL2–CCR2（7.2）、TGF-β/TGFBR1（6.5）、整合素-ECM-FAK（6.0）和HIF-1α/CA9（5.2）。以地法替尼靶向FAK进行功能验证，在巨噬细胞条件培养下，地法替尼联合替莫唑胺使细胞活力、集落形成和迁移分别降低56.0%、61.3%和57.8%，并显著下调CD44、CHI3L1和SERPINE1 mRNA表达，同时减弱磷酸化FAK和磷酸化SRC蛋白水平。
四、讨论与结论
研究人员指出，单细胞核分析证实成人弥漫性胶质瘤并非由稳定互斥的细胞表型组成，恶性细胞占据连接AC-like、OPC-like、NPC-like和MES-like状态的连续转录谱系，支持局部环境压力促进状态转变而非简单选择固定克隆的模型。空间分析为转录组发现增加了关键的解剖维度：低氧集中在坏死旁区域，SPP1/APOE相关髓系程序富集于免疫致密和低氧区域，高风险生态系统中恶性细胞与髓系细胞的紧密空间邻近提示可能存在主动的交互信号传导而非被动共存。组织验证队列证实生态系统状态具有临床相关性，ES3状态与显著缩短的生存期相关，且在校正常规临床和分子变量后仍具独立预后价值。连续生态系统风险评分的独立预后意义表明，空间信息化的生态系统评估可补充传统分子分类，通过捕获肿瘤基因型无法反映的多细胞网络和治疗相关空间互作，为个体化微环境干预提供转化桥梁。
研究结论为：空间组织的肿瘤-免疫生态系统提供预后信息，并凸显胶质母细胞瘤中潜在可靶向的SPP1–CD44/FAK–SRC信号通路，该通路在低氧髓系-间充质生态系统状态中高度激活，可作为个体化治疗分层策略的候选靶点。
