《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：First isolation of three Orientia tsutsugamushi strains (Boryong, Kawasaki, and Yonchon) from trombiculid mites in the Republic of Korea
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恙虫病（scrub typhus）是一种由恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）引起的急性发热性疾病，该病原体为专性胞内细菌，通过恙螨（trombiculid mites）传播。尽管已在人类患者中鉴定出多种O. tsutsugamushi
恙虫病（scrub typhus）是一种由恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）引起的急性发热性疾病，该病原体为专性胞内细菌，通过恙螨（trombiculid mites）传播。尽管已在人类患者中鉴定出多种O. tsutsugamushi菌株，但从恙螨中回收活菌株在技术上仍具挑战。本研究报道了从韩国野外采集的恙螨中成功分离并稳定建立三株O. tsutsugamushi菌株，即Boryong、Kawasaki和Yonchon。研究人员于2025年11月从四个地区（Cheorwon、Cheongju、Geoje和Hapcheon）的野生啮齿动物身上收集恙螨，经表面消毒、匀浆后筛选O. tsutsugamushi阳性样本。将阳性匀浆腹腔接种免疫缺陷型NOD.SCID小鼠进行体内扩增，随后将出现临床症状的小鼠脾脏匀浆接种至L929细胞系中进行体外传代培养。通过细胞病变效应样形态学变化、免疫荧光试验（IFA）、实时定量PCR（qPCR）、巢式PCR以及56-kDa tsa基因和47-kDa htrA基因测序确认分离成功。系统发育分析表明，所建立的分离株聚类于已知的Boryong、Kawasaki和Yonchon谱系。所有分离株均能在体外连续传代中稳定维持，表现出稳健的胞内复制能力，且未检测到与其他代表性蜱媒和恙螨媒胞内细菌的共感染。本研究提供了直接证据，证明活性的O. tsutsugamushi菌株在自然恙螨种群中得以维持，并可通过体内-体外联合方法成功分离，这是韩国首次从恙螨中成功分离菌株，也是首次从自然恙螨宿主中回收Boryong、Kawasaki和Yonchon菌株。这些媒介来源的分离株为未来恙虫病的生态学、分子流行病学、发病机制及预防研究提供了宝贵的生物资源。
研究背景与目的
恙虫病（scrub typhus）是由恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）引起的一种急性发热性疾病，该病原体为专性胞内细菌，主要通过恙螨（trombiculid mites）幼虫叮咬传播给人类。在韩国，该病每年报告约4000例，流行高峰集中在秋季（10月至11月）。尽管传统上认为该病局限于亚太地区，但近年来在南美洲和中东等非传统流行区也发现了新型Orientia物种，提示其地理分布可能比以往认知的更广。由于恙虫病早期临床表现常缺乏特异性，易与其他急性发热性疾病混淆，可能导致诊断和治疗延误，增加重症风险。因此，分离和鉴定流行的O. tsutsugamushi菌株对于理解其遗传多样性和区域分布具有重要意义。
目前，已有大量菌株从人类患者中分离并报道，但直接从恙螨（即该病原体的主要生物媒介和自然储存宿主）中回收活菌株的报告极为罕见。从恙螨中分离菌株面临技术挑战，包括恙螨体型微小（约150–300 μm）、细菌载量低以及病原体的严格胞内生长需求。然而，从媒介中获得活菌株对于研究病原体在自然宿主中的维持机制以及评估其与人类感染的潜在关联至关重要。本研究旨在从韩国不同地理区域的野外采集恙螨中成功分离并稳定建立O. tsutsugamushi活菌株。
研究方法概述
研究人员于2025年11月在韩国四个地区（北部Cheorwon、中部Cheongju、南部Geoje和Hapcheon）使用Sherman折叠活捕陷阱捕获野生啮齿动物，收集其体表恙螨。每50只恙螨作为一个混合样本，经1%次氯酸钠表面消毒后匀浆制备接种物。将阳性匀浆腹腔接种免疫缺陷型NOD.SCID小鼠进行体内扩增，监测临床症状。出现明显症状的小鼠被安乐死后取脾脏，脾脏匀浆用于接种L929小鼠成纤维细胞系进行体外培养和传代。通过观察细胞病变效应（CPE）样形态变化、免疫荧光试验（IFA）、实时定量PCR（qPCR）、巢式PCR及56-kDa tsa基因和47-kDa htrA基因测序和系统发育分析确认分离株的身份和纯度。同时，通过巢式PCR排除了其他蜱媒和恙螨媒胞内细菌（如立克次体属、无形体属、埃立克体属、疏螺旋体属和贝氏柯克斯体）的共感染。
研究结果
3.1 初代分离用O. tsutsugamushi菌株的鉴定**
测序结果显示，来自Hapcheon的恙螨携带Boryong菌株，来自Cheongju和Geoje的恙螨携带Kawasaki菌株，来自Cheorwon的恙螨携带Yonchon菌株。这些菌株被选作病原体分离的候选对象。
3.2 NOD.SCID小鼠中O. tsutsugamushi分离的确认**
qPCR分析显示，所有接种阳性恙螨匀浆的小鼠脾脏样本中均检出O. tsutsugamushi，Ct值较低（21.64–23.94），表明细菌在小鼠体内有效扩增。测序证实从小鼠脾脏中分离的病原体与接种所用恙螨匀浆中检测到的菌株基因序列一致。而接种阴性对照匀浆或PBS的小鼠始终呈PCR阴性。
3.3 L929细胞培养中O. tsutsugamushi分离株的建立**
接种感染小鼠脾脏匀浆的L929细胞在感染后3天出现CPE样形态变化，而未感染对照组无此现象。IFA显示感染细胞核周区域出现明亮的绿色荧光信号。qPCR分析显示感染细胞的Ct值较低（17.24–20.1），证实了O. tsutsugamushi在细胞内活跃复制。
3.4 O. tsutsugamushi分离株在连续传代中的稳定性
经过两次连续传代后，IFA仍显示一致的荧光信号，qPCR Ct值持续较低（15.87–19.63）。针对56-kDa tsa和47-kDa htrA基因的巢式PCR及测序确认，连续传代后的分离株与原始恙螨匀浆和小鼠脾脏中检测到的菌株基因序列相同。系统发育分析进一步表明，这些分离株分别聚类于Boryong、Kawasaki和Yonchon菌株的既定谱系，证明分离株在体外连续传代中稳定维持并保留了原始菌株的遗传特征。
3.5 O. tsutsugamushi分离株的质量评估与保藏
所有分离株均未检测到立克次体属、无形体属、埃立克体属、疏螺旋体属和贝氏柯克斯体等胞内细菌的共感染。验证后的Boryong、Kawasaki和Yonchon分离株以感染细胞库存的形式冷冻保存在-70 °C，并随后保藏在韩国国家病原体保藏中心（NCCP）。
讨论与结论
本研究的讨论部分指出，成功从野外采集的恙螨中回收并稳定传代O. tsutsugamushi活菌株，证实了恙螨作为自然储存宿主在维持病原体中的作用，并超越了以往仅依赖PCR检测DNA的方法，直接证明了恙螨中存在活菌。分离到的Boryong、Kawasaki和Yonchon菌株此前已在韩国人类病例和媒介监测中被报道，本研究为其在自然媒介中的存在提供了直接证据。研究人员还讨论了实验中的一些观察，例如约30%接种小鼠出现临床症状的时间差异，这可能与接种物中感染恙螨比例不均、细菌活力损失或注射操作变异有关。脾脏被选为分离组织，因其富含细胞且便于获取足够材料。研究强调了几个关键技术策略的重要性：次氯酸钠表面清洗去除外部污染、使用免疫缺陷NOD.SCID小鼠提供允许性环境以扩增低载量病原体、以及在培养基中添加青霉素-链霉素抑制胞外菌生长。系统排除其他胞内细菌共感染确保了分离株的纯度。
研究结论：本研究成功从恙螨中回收并建立了O. tsutsugamushi菌株，增强了研究人员对恙虫病生态学的理解，并为未来的分子流行病学、诊断方法开发、疫苗候选物评估和病原体特征研究提供了重要的实验基础。所建立的分离株已保藏于生物资源库，确保其作为标准化研究资源的可及性。未来研究应利用下一代测序等高分辨率基因组学方法进一步表征这些分离株，并与临床来源的菌株进行比较基因组学和抗原学分析，以阐明菌株特异性特征及其与致病性和诊断性能相关的分子决定因素。
