自愿跑轮训练联合EGb 761?对单侧迷路切除大鼠区域突触密度及行为恢复的协同改善作用

《Frontiers in Neurology》：Voluntary physical activity and pharmacological treatment with the Ginkgo biloba extract EGb 761 alleviate regional alterations in cerebral synaptic density and improve behavioral recovery after unilateral labyrinthectomy in the rat

　　

背景：单侧外周前庭丧失（unilateral peripheral vestibular loss）可诱导大脑可塑性的适应性机制。已量化的银杏叶提取物EGb 761?已被证明可增强神经可塑性，并用于眩晕和头晕的治疗。研究人员在此旨在研究，在化学单侧迷路切除（chemical unilateral labyrinthectomy, cUL）大鼠中，跑轮训练（running wheel training, RWT）形式下的自愿体力训练与EGb 761?口服治疗如何影响行为恢复和全脑突触密度（synaptic density）。

方法：将32只Sprague Dawley大鼠分为4个采用不同治疗方案的处理组（第1组：对照食物；第2组：对照食物+RWT；第3组：EGb 761?食物（75 mg/day/kg体重）；第4组：EGb 761?食物+RWT）。所有大鼠均通过经鼓室注射布比卡因（bupivacaine）和对氨基苯砷酸（p-arsanilic acid）实施左侧cUL。行为学测试（眼震（nystagmus）、姿势不对称（postural asymmetry）、头倾斜（head tilt）、旷场运动轨迹追踪（locomotion tracking in open field）评分）每周进行，直至cUL后9周（d63）。在cUL前及cUL后至9周进行系列[¹⁸F]UCB-H μPET成像以检测突触密度（靶向突触囊泡蛋白2A（synaptic vesicular protein 2A, SV2A））。图像进行全脑归一化，并基于Schiffer图谱分割。比较各组及各时间点脑内[¹⁸F]UCB-H摄取在体素水平和区域水平的变化。

结果：所有大鼠在cUL后均表现出急性前庭综合征体征。EGb 761?+RWT组在单侧迷路切除后第5周（post UL）前姿势不对称的改善显著更快、更完全，且此后运动速度高于对照食物组。与基线相比，cUL后d63时，EGb 761?组前庭核（vestibular nuclei）突触密度降低最小，为?7.59 ± 7.0%（对照食物组为?20.37 ± 5.18%，p < 0.001）。相反，cUL后d63时，对照食物组运动皮层（motor cortex）突触密度相对增加最高（6.6 ± 3.13%，EGb 761?组为0.19 ± 2.81%，p < 0.001）。与对照食物组相比，所有治疗组在cUL后1–3周海马区（hippocampal area）和体感皮层（somatosensory cortex）突触密度均增加。EGb 761?与RWT的相加效应在行为学和PET测量中得到统计学确认。

结论：单侧迷路切除诱导前庭-小脑网络突触密度丢失，EGb 761?治疗可部分逆转该丢失。物理与EGb 761?联合治疗对cUL后行为恢复的改善最有效，强化了急性前庭病（acute vestibulopathies）多模式治疗的重要性。

急性单侧前庭丧失可导致前庭张力不对称症状，包括眩晕、视振荡、跌倒倾向或步态共济失调，随后通过中枢前庭代偿（central vestibular compensation；前庭损伤后中枢神经系统通过可塑性恢复功能的过程）逐步恢复，其驱动力为病变诱导的适应性神经可塑性。现代治疗理念强调通过早期、强化的前庭物理治疗促进中枢前庭代偿；尽管前庭物理治疗对单侧前庭丧失的治疗获益证据较多，但其神经生物学机制仍不清晰。同时，训练效果可被增强脑神经可塑性的药物所放大，如已量化的多价银杏叶提取物EGb 761?。既往动物模型研究显示，EGb 761?可加速单侧前庭丧失后的功能恢复，该剂量依赖性疗效由ginkgolide A和B介导，并部分通过改变中枢前庭网络枢纽的脑葡萄糖代谢实现；组织学分析还发现EGb 761?可促进去传入前庭核的突触再占据。EGb 761?及其成分在多种模型中影响海马突触传递效率、神经元连接、神经突起生长及CREB磷酸化等可塑性相关过程。基于此，研究人员开展四臂研究，直接比较自愿跑轮训练（running wheel training, RWT；允许大鼠自愿在跑轮中运动的干预）、EGb 761?药物治疗及二者联合相对于对照条件对单侧迷路切除（chemical unilateral labyrinthectomy, cUL；经化学方法破坏单侧内耳前庭末梢）后行为恢复的影响，并利用系列活体[¹⁸F]UCB-H μPET（靶向突触囊泡蛋白2A（synaptic vesicle protein 2A, SV2A）的正电子发射断层成像）分析纵向全脑突触密度（synaptic density；单位脑组织内突触标志信号强度）差异。研究假说为：EGb 761?与自愿RWT可分别通过增强去传入中枢前庭枢纽的突触再占据及脑感觉运动网络突触可塑性来增强前庭代偿；联合干预对前庭不对称的行为恢复具有更优效果。该研究旨在阐明联合物理与药理干预靶向适应性病变诱导神经可塑性，能否同时增强功能恢复和突触可塑性。

研究人员将32只雄性Sprague-Dawley大鼠（3月龄，平均400 ± 20 g；Charles River Ltd, UK）分为4组：对照食物组、对照食物+RWT组、EGb 761?食物组（75 mg/day/kg体重）及EGb 761?食物+RWT组。EGb 761?或对照食物自cUL前6周开始给予。所有大鼠接受左侧cUL，经鼓室注射布比卡因和p-arsanilic acid。行为学评分于基线及cUL后d1、d2、d3、d5、d7，随后每周至第9周进行，包括眼震、姿势不对称、头倾斜、提尾旋转试验及旷场自动视频追踪。系列[¹⁸F]UCB-H μPET于基线及cUL后第1、3、9周进行，图像全脑归一化并按图谱分割，开展体素水平和区域水平分析，采用混合效应模型等统计方法。研究得出，EGb 761?与RWT联合可最有效改善cUL后行为恢复，并在前庭核、运动皮层等区域伴随相应突触密度改变；EGb 761?可减轻前庭核突触丢失，联合干预还增加海马区突触密度。这支持多模式干预在急性前庭病中的应用价值。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究纳入32只雄性Sprague-Dawley大鼠（Charles River Ltd, UK），分为四组实施对照食物、EGb 761?掺食（75 mg/day/kg）、自愿RWT及其联合干预；采用经鼓室注射布比卡因与p-arsanilic acid建立左侧cUL模型；以盲法临床前庭不对称评分和旷场自动视频追踪评估行为；以系列[¹⁸F]UCB-H μPET（SV2A靶向）在基线和cUL后第1、3、9周检测全脑突触密度，并经全脑归一化、图谱分割及体素/区域分析；采用累积连接混合模型、线性混合模型和混合效应模型进行统计比较。

结果如下。前庭不对称的临床评分（Clinical scoring of vestibular asymmetry）：通过盲法行为评分发现，所有大鼠cUL后均出现明显单侧前庭损伤体征；姿势不对称因p-arsanilic acid延迟毒性在术后早期升高（对照食物组峰值d5，其他组d3），随后各组下降但速率不同，仅EGb 761?+RWT组从d35后未检测到姿势不对称临床体征，其他组至d63仍有轻度残余；EGb 761?+RWT组在早期（d1–d14）和晚期（d21–d63）与对照食物组差异显著。头倾斜在d5–7达峰后改善，除EGb 761?+RWT组外其余组持续至d63；EGb 761?+RWT组d42–d56无头倾斜，d35–63评分显著低于对照食物组。眼震在d1达峰，EGb 761?+RWT组最早于d5消退，仅时间效应显著。提尾旋转试验所有组术后各时点均阳性，仅时间效应显著，组间无显著差异。跑轮累计持续时间cUL后明显下降并至第9周低于基线，组间均值无显著差异。旷场测试中的定量运动参数（Quantitative locomotor parameters in open field testing）：通过旷场自动追踪发现，平均速度受时间、食物、时间×食物及时间×RWT显著影响；d1时所有组运动速度和累计运动持续时间较基线下降，d7后高于基线；自d28起EGb 761?+RWT组速度最高，并在d35–63显著高于对照食物组。中心停留累计时间呈类似模式，受时间、食物、RWT及交互影响，d14–d63各治疗组与对照食物组差异显著。经[¹⁸F]UCB-H μPET可视化的全脑及区域突触密度活体变化（In vivo changes of whole-brain and regional synaptic density visualized by [¹⁸F]UCB-H μPET）：通过纵向μPET及体素/区域分析发现，与基线相比，除EGb 761?组外，各组前庭核突触密度在d63达丢失峰值；对照食物组最早于d21出现且d63前庭核和前庭小脑丢失最明显；EGb 761?+RWT和对照食物+RWT减轻9周时前庭核突触丢失，EGb 761?组d63突触密度接近基线。与对照食物组相比，EGb 761?组前庭核和前庭小脑突触密度相对增加，EGb 761?+RWT组前庭小脑增加，对照食物+RWT组无此改变。体感皮层中，治疗组2–4在cUL后1周较对照食物组增加，EGb 761?组第3周增强，EGb 761?+RWT组至第9周增强。海马区在d7和d21出现相对突触增益，EGb 761?+RWT组d7最强。区域分析显示，前庭核突触密度变化受时间、EGb 761?×RWT及时间×EGb 761?×RWT显著影响；运动皮层受时间、时间×EGb 761?及时间×EGb 761?×RWT显著影响。d63时前庭核突触丢失最大者为对照食物组（?20.37 ± 5.18%），显著高于对照食物+RWT（?10.32 ± 7.41%，p = 0.022）和EGb 761?组（?7.59 ± 7.0%，p < 0.001）；运动皮层d63相对增益最高者为对照食物组（6.60 ± 3.13%），显著高于EGb 761?+RWT（1.84 ± 4.19%，p = 0.01）和EGb 761?组（0.19 ± 2.82%，p < 0.001）。

讨论部分总结：研究主要发现为，EGb 761?与RWT联合驱动cUL后静态前庭缺陷（头倾斜、姿势不对称）恢复并改善运动行为，纵向混合效应模型显示头倾斜和姿势不对称存在显著时间×食物×RWT交互，提尾旋转试验呈类似趋势；眼震呈纯时间依赖的急性升高与消退过程，未受治疗调节。旷场行为与临床前庭评分所受影响不同：临床评分显示显著三阶交互，旷场参数主要受时间、EGb 761?、RWT的主效应及低阶交互影响，提示探索性运动行为与临床前庭恢复可能由部分不同过程介导。PET结果与行为模式相呼应：前庭核和运动皮层突触密度存在显著时间×食物×RWT交互，提示联合治疗的行为获益伴随前庭和运动相关区域的结构相关改变，而非单纯症状掩盖；EGb 761?单独最有效减少前庭核和前庭小脑病变诱导的突触丢失，EGb 761?+RWT还增加海马形成区突触密度；体感皮层各治疗组相对对照增加，可能反映代偿过程中多感觉皮层募集；前庭核突触丢失更明显时运动皮层突触增益更高，提示继发性适应运动皮层重塑。研究确认EGb 761?可改善单侧外周前庭病变后静态和动态前庭功能的行为恢复，并首次在动物模型中显示EGb 761?联合自愿跑轮活动对行为代偿具有加性获益。EGb 761?可能在9周时使前庭核突触丢失相对对照减轻约三分之二；RWT亦减少前庭核突触丢失但程度低于EGb 761?。局限包括：突触密度仅通过纵向[¹⁸F]UCB-H PET评估，无组织学验证；全脑体素分析采用未校正阈值，属探索性；EGb 761?经食物ad libitum给予而未量化个体摄入；仅研究雄性大鼠；训练强度与药理调节的交互以及兴奋性与抑制性突触变化仍有待未来研究。

研究结论部分翻译：总之，本研究强化了前庭疾病多模式治疗策略的价值。通过将EGb 761?的神经保护和突触生成作用与自愿跑轮训练诱导的活动依赖性可塑性相结合，该干预似乎靶向互补机制，从而产生更有效、更稳健的恢复。这些发现支持在神经耳科学中开发个体化康复方案，整合药理和行为成分以最大化功能结局。