补肾健脾活血方（BSJPHXF）调节去卵巢绝经后骨质疏松大鼠FGF23-Klotho骨-肾轴及钙磷代谢的研究

《Frontiers in Endocrinology》：BSJPHXF modulates the FGF23-Klotho bone-kidney axis and calcium-phosphorus metabolism in ovariectomized rats with postmenopausal osteoporosis

　　

目的：探讨补肾健脾活血方（BSJPHXF，亦称骨康方）对绝经后骨质疏松症大鼠模型中FGF23-Klotho骨-肾轴及钙磷代谢的影响。 方法：将40只SPF级雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、去卵巢组（OVX；模型组）、BSJPHXF组和六味地黄丸组（LWDHW；阳性对照组），每组10只，在12周恢复期后灌胃治疗4周。采用自动生化分析法测定血清钙和磷；采用ELISA法检测血清FGF23、甲状旁腺激素（PTH）和1,25-二羟基维生素D3 [1,25-(OH)2D3]；采用Western blot检测肾脏Klotho、NaPi-IIa和1α-羟化酶（Cyp27b1）；采用Micro-CT评估骨微结构；采用HE染色观察肾脏组织病理学。各组9只动物进行血清生化和ELISA检测，各组3只动物进行Western blot、Micro-CT和组织学检测；以大鼠为实验单位。 结果：与假手术组相比，OVX组大鼠血清钙（1.997 ± 0.109 vs. 2.547 ± 0.189 mmol/L）和1,25-(OH)2D3（102.21 ± 2.87 vs. 201.74 ± 5.85 pg/mL）降低，而血清磷（2.019 ± 0.099 vs. 1.355 ± 0.027 mmol/L）、FGF23（366.82 ± 28.36 vs. 159.52 ± 20.39 pg/mL）和PTH（141.63 ± 15.29 vs. 33.91 ± 7.59 pg/mL）升高（均P<0.001）。BSJPHXF可减轻这些相对于OVX的变化（P<0.001）。BSJPHXF与LWDHW在钙、FGF23或PTH方面无差异，而LWDHW在降低血清磷（1.463 ± 0.062 vs. 1.587 ± 0.048 mmol/L, P = 0.0015）和升高1,25-(OH)2D3（174.66 ± 7.00 vs. 156.54 ± 13.09 pg/mL, P = 0.0002）方面效果更优。Micro-CT显示，与OVX组相比，BSJPHXF而非LWDHW改善了骨小梁体积分数、分离度和数量，且BSJPHXF在这三项指标上均优于LWDHW；各组间骨小梁厚度无差异。 结论：在OVX大鼠中，BSJPHXF减轻了钙磷代谢紊乱，伴随肾脏Klotho、NaPi-IIa和Cyp27b1以及循环中FGF23、PTH和1,25-(OH)2D3的变化，并改善了骨小梁微结构。由于机制上最重要的终点依赖于每组三只动物，且未测量功能性肾脏参数，这些发现属于初步性和假设生成性的。

一、研究背景与研究问题

骨质疏松症（Osteoporosis, OP）是一种以骨量减少、骨微结构退化和脆性增加为特征的系统性代谢性骨骼疾病，易导致脆性骨折。随着人口老龄化，全球超过2亿人受其影响，约三分之一的女性及五分之一的男性在50岁后将发生骨质疏松性骨折。绝经后骨质疏松症（Postmenopausal Osteoporosis, PMOP）是最常见的类型，主要由绝经后雌激素水平下降引起。肾脏是矿物质稳态的主要调节器官，而抗衰老蛋白Klotho主要在肾小管细胞中表达，其缺乏会导致血管钙化、皮肤萎缩和骨质疏松等类似加速人类衰老的综合征。中医认为骨质疏松症根源于“肾精亏虚”，而分子研究已确定成纤维细胞生长因子23（FGF23）-Klotho内分泌通路是骨与肾之间调节磷酸盐和维生素D稳态的核心枢纽。

目前存在的问题包括：尽管已有多种药物用于治疗PMOP，但传统中药复方的具体作用机制仍不清晰，尤其是补肾健脾活血方（BSJPHXF，又名骨康方）对FGF23-Klotho骨-肾轴及其下游钙磷代谢调控的影响尚未被充分阐明。因此，研究人员利用去卵巢（OVX）大鼠这一经典的雌激素缺乏诱导骨丢失模型，旨在探究BSJPHXF对该轴的作用，为后续机制研究和临床转化提供假设基础。

二、研究内容与主要结论

研究人员将40只SPF级雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、OVX模型组、BSJPHXF组和六味地黄丸（LWDHW）阳性对照组，每组10只。经过12周恢复期后，给药组分别灌胃相应药物4周。通过检测血清钙磷、ELISA测定血清FGF23、甲状旁腺激素（PTH）和1,25-(OH)₂D₃、Western blot检测肾脏Klotho、钠-磷协同转运蛋白IIa（NaPi-IIa）和1α-羟化酶（Cyp27b1）的表达、Micro-CT评估股骨远端骨微结构以及HE染色观察肾脏组织病理学。

主要结论：BSJPHXF能够部分逆转OVX引起的钙磷代谢紊乱，表现为升高血清钙和1,25-(OH)₂D₃、降低血清磷、FGF23和PTH水平；同时上调肾脏Klotho和Cyp27b1表达、下调NaPi-IIa表达，并改善骨小梁微结构（提高骨体积分数和骨小梁数量、降低骨小梁分离度）。这些效应与LWDHW部分相似，但在改善骨微结构方面BSJPHXF显著优于LWDHW。然而，由于机制性终点（Western blot、Micro-CT）仅基于每组3只动物，且缺乏肾功能参数，这些发现应被视为初步性和假设生成性的。

三、关键技术方法

1. 1.
   动物模型建立：采用双侧卵巢切除术（OVX）建立绝经后骨质疏松大鼠模型，假手术组仅暴露卵巢但不切除；所有大鼠来源于广州中医药大学实验动物中心（生产许可证号SCXK(粤)2023-0347）。
2. 2.
   血清生化与内分泌检测：使用全自动生化分析仪测定血清钙和磷；采用双抗体夹心ELISA试剂盒检测血清FGF23、PTH和1,25-(OH)₂D₃。
3. 3.
   蛋白质免疫印迹（Western blot）：提取肾脏组织蛋白，使用特异性抗体检测Klotho（分泌型胞外域~62 kDa）、NaPi-IIa（全长功能型~75 kDa）和Cyp27b1（~35 kDa）的蛋白表达水平，以GAPDH为内参。
4. 4.
   显微计算机断层扫描（Micro-CT）：对股骨远端干骺端进行扫描（各向同性体素20 μm），分析骨小梁体积分数（Tb.BV/TV）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）。
5. 5.
   组织病理学检查：肾脏组织经石蜡包埋、切片后进行苏木精-伊红（HE）染色，于光学显微镜下观察肾小管和肾小球形态变化。

四、研究结果

3.1 Micro-CT发现

与假手术组相比，OVX组大鼠骨小梁体积分数（Tb.BV/TV）和骨小梁数量（Tb.N）显著降低，骨小梁分离度（Tb.Sp）显著升高（均P<0.001），表明OVX成功诱导了骨小梁丢失和微结构退化。骨小梁厚度（Tb.Th）在各组间无显著差异。BSJPHXF显著逆转了OVX引起的上述三项参数变化（均P<0.01 vs. OVX），而LWDHW未能显著逆转任何一项参数。BSJPHXF在所有三项参数上均显著优于LWDHW（Tb.BV/TV P=0.004; Tb.Sp P=0.032; Tb.N P=0.043）。

3.2 血清钙、磷、FGF23、PTH和1,25-(OH)₂D₃水平

与假手术组相比，OVX组大鼠血清钙和1,25-(OH)₂D₃降低，血清磷、FGF23和PTH升高（均P<0.0001），提示钙磷代谢紊乱和继发性甲状旁腺功能亢进。BSJPHXF和LWDHW均能显著升高血清钙和1,25-(OH)₂D₃、降低血清磷、FGF23和PTH（均P<0.0001 vs. OVX）。两种药物在钙、FGF23和PTH方面无显著差异，但LWDHW在降低血清磷和升高1,25-(OH)₂D₃方面效果显著优于BSJPHXF（磷P=0.0015；1,25-(OH)₂D₃ P=0.0002）。

3.3 肾脏Klotho、NaPi-IIa和Cyp27b1蛋白表达

与假手术组相比，OVX组肾脏Klotho和Cyp27b1蛋白条带强度降低，而NaPi-IIa强度升高（均P<0.01）。BSJPHXF或LWDHW处理后呈现相反模式（均P<0.01 vs. OVX），即上调Klotho和Cyp27b1、下调NaPi-IIa。

3.4 肾脏组织病理学观察

假手术组肾小球完整，肾小管排列规则，上皮细胞形态正常。OVX组可见肾小管上皮细胞空泡变性、部分肾小管扩张及管腔内偶见蛋白管型。BSJPHXF和LWDHW组肾小管改变较轻，排列改善，空泡变性减少。这些仅为定性描述性观察，未进行半定量评分。

五、讨论与结论

讨论部分总结：研究人员指出，OVX大鼠出现的血清FGF23升高、1,25-(OH)₂D₃降低及PTH升高等现象，与FGF23-Klotho轴失调一致。BSJPHXF可能通过两条互补途径发挥作用：一是调节肾脏α-Klotho-FGF23信号进而影响钙磷代谢；二是通过Wnt/β-catenin和BMP通路直接作用于骨细胞。该研究的主要局限性在于：（1）关键的形态学和分子学终点（Western blot、Micro-CT、组织学）每组仅3只动物，统计效力有限；（2）未测量尿磷排泄、肾Cyp24a1表达及下游FGFR信号，无法直接证明FGF23抵抗；（3）缺乏肾功能参数和盲法半定量组织学评分；（4）未进行骨组织形态计量学、骨转换标志物和力学测试；（5）未测量血清性激素浓度确认雌激素缺乏状态；（6）未进行通路特异性抑制剂实验验证直接分子靶点。因此，这些发现属于初步性和假设生成性的。

研究结论翻译：在OVX大鼠中，BSJPHXF减轻了钙磷代谢紊乱，伴随血清FGF23、PTH和1,25-(OH)₂D₃以及肾脏Klotho、Cyp27b1和NaPi-IIa表达的变化，这与调节FGF23-α-Klotho骨-肾内分泌轴一致；此外，BSJPHXF在改善骨小梁微结构方面优于LWDHW。鉴于形态学和分子学终点每组仅评估3只动物——尽管生化终点每组有9只动物——且缺乏功能性肾脏和骨骼终点，这些发现属于初步性和假设生成性的，需要进一步具有足够样本量的研究来确定其在绝经后骨质疏松症中的因果关系和临床相关性。