《Frontiers in Immunology》：CRTAM enhances T cell antimicrobial activity, particularly CD8+ T cells, against Mycobacterium tuberculosis infection
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**背景：** 针对结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*, Mtb）的保护性宿主免疫机制尚未完全阐明。Resisters是指长期暴露于Mtb但反复免疫学检测仍为阴性的个体，为研究保护性免疫反应提供了独特机会。本研究系统探究了
**背景：** 针对结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*, Mtb）的保护性宿主免疫机制尚未完全阐明。Resisters是指长期暴露于Mtb但反复免疫学检测仍为阴性的个体，为研究保护性免疫反应提供了独特机会。本研究系统探究了Resisters中CXCR3+CD107a+效应细胞的功能特征，旨在识别与保护性抗分枝杆菌免疫相关的潜在分子。
**方法：** 研究人员采用mRNA测序技术探究Resisters和结核病患者中CXCR3+CD107a+效应淋巴细胞的转录特征。利用流式细胞术评估CRTAM表达及效应表型，并通过菌落形成单位（colony-forming units, CFU）实验量化感染巨噬细胞中的细菌载量。利用*Crtam*基因缺陷小鼠和野生型小鼠研究CRTAM在体内对宿主控制分枝杆菌感染的功能。
**结果：** 对从Resisters中分离的CXCR3+CD107a+效应淋巴细胞的mRNA测序显示，CRTAM表达升高，且其表达水平与抗分枝杆菌效应分子呈正相关。慢性Mtb感染患者的CRTAM水平较低。分枝杆菌刺激可快速上调CRTAM表达，尤其在CD8+ T细胞中。CRTAM的表达及激动性CRTAM刺激与增强的T细胞效应反应及抑制胞内分枝杆菌生长相关。*Crtam*缺陷小鼠对分枝杆菌感染的易感性增加，而重组CRTAM给药则赋予了显著的免疫保护。
**结论：** 这些发现将CRTAM鉴定为一种有助于抗分枝杆菌效应反应的保护性免疫相关分子。重组CRTAM的研究结果提供了初步的体内概念验证，表明CRTAM能够调节Mtb感染期间的感染相关结局，支持其作为免疫调节分子进行进一步研究。
### 论文解读文章
**一、研究背景与问题提出**
结核病（Tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*, Mtb）引起，依然是全球最致命的传染病之一。尽管开展了大量研究，但针对Mtb感染的保护性宿主免疫机制尚未完全阐明。近年来，一类被称为“Resisters”的特殊群体引起了科学界的关注。这些个体是结核病患者的密切接触者，长期高剂量暴露于Mtb，但反复的干扰素-γ释放试验（interferon-gamma release assay, IGRA）和结核菌素皮肤试验均持续阴性。然而，他们体内存在针对Mtb特异性抗原（如ESAT-6和CFP-10）的抗体反应和非IFN-γ T细胞反应，这为Mtb暴露提供了免疫学证据。
Resisters表型提示其可能具备强大的先天或先天样免疫系统，能够在不产生经典适应性T细胞反应的情况下迅速清除感染的细菌。这种独特的表型使其成为研究抗结核保护性免疫的关键人群。本研究旨在通过系统探究Resisters中特定效应细胞亚群的功能特征，寻找与保护性抗分枝杆菌免疫相关的关键分子，从而为理解抗TB免疫机制和开发新的免疫治疗策略提供依据。
**二、研究技术与方法**
为达成研究目标，研究人员采用了多项关键技术方法。
1. **转录组学分析：** 利用mRNA测序技术，对从Resisters和活动性肺结核（active pulmonary tuberculosis, ATB）患者外周血中分选的CXCR3
+CD107a
+（双阳性，DP）和CXCR3
-CD107a
-（双阴性，DN）效应淋巴细胞进行转录组测序。同时，也对体外激活后分选的CD3
+CRTAM
+和CD3
+CRTAM
- T细胞进行了RNA测序。测序数据经过生物信息学分析，包括差异表达基因鉴定、基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。
2. **体外细胞功能实验：** 建立了T细胞（或外周血单个核细胞，peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）与Mtb或卡介苗（*Mycobacterium bovis* BCG）感染的巨噬细胞（包括人单核细胞来源的巨噬细胞hMDMs和THP-1细胞）共培养体系。通过菌落形成单位（colony-forming units, CFU）实验量化巨噬细胞内的细菌载量，以评估不同处理条件下T细胞的抗分枝杆菌能力。这些处理包括使用CRTAM敲低或过表达的慢病毒感染T细胞、加入激动性抗CRTAM抗体或重组人CRTAM蛋白。
3. **流式细胞术：** 用于检测T细胞表面CRTAM的表达动力学，以及在特定刺激下（如抗CD3/CD28抗体、BCG、Mtb H37Rv裂解液等）CD4
+和CD8
+ T细胞亚群中CRTAM的表达情况。同时，也用于分析T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-17A、颗粒溶素（granulysin, GNLY）、穿孔素（perforin, PRF）和颗粒酶B（granzyme B, GZMB）等效应分子的能力。
4. **小鼠感染模型：** 使用*Crtam*基因缺陷（*Crtam*-/-）和野生型（wild-type, WT）C57BL/6小鼠，通过静脉或鼻内途径感染BCG、*M. smegmatis*或毒力Mtb H37Rv菌株。在感染后特定时间点，通过CFU实验评估肺脏和脾脏的细菌载量，并通过苏木精-伊红（H&E）染色和Ziehl-Neelsen染色进行组织病理学分析。此外，还进行了重组小鼠CRTAM蛋白（rmCRTAM）的体内给药治疗实验，以评估其保护效果。本研究中使用的Resisters、ATB患者和健康对照（HC）样本分别来自同济大学附属上海市肺科医院。
**三、主要研究结果**
1. **Resisters中CXCR3
+CD107a
+效应淋巴细胞高表达CRTAM并与效应细胞因子共表达**
对Resisters和ATB患者的DP（CXCR3
+CD107a
+）和DN（CXCR3
-CD107a
-）细胞的转录组分析显示，Resisters供体的DP细胞中CRTAM表达水平约为其DN细胞的3倍，而在ATB患者中两者无显著差异。ATB患者DP细胞的CRTAM平均表达水平仅为Resisters的约25%。通过分析公共数据集（GSE56153和GSE19435）进一步发现，ATB患者的CRTAM表达低于健康对照，且随着抗TB治疗（0、2、12个月）而逐步恢复。对Resisters DP细胞中上调的62个基因进行KEGG通路分析，发现主要富集在细胞间相互作用和NK细胞介导的细胞毒性通路。相关分析表明，CRTAM的表达与IFN-γ、颗粒酶B和TNFRSF9等细胞毒性相关分子的表达呈显著正相关。
2. **CRTAM在Mtb抗原刺激的活化T细胞（尤其是CD8
+ T细胞）上快速表达**
体外实验显示，经抗CD3/CD28抗体刺激后，CD3
+ T细胞中CRTAM的表达在6小时开始显著上升，而CD4
+ T细胞中CRTAM表达始终低于1%。相比之下，CD8
+ T细胞在刺激6小时后有25-40%表达CRTAM，且该高表达可持续至24小时。在未受刺激的状态下，ATB患者的CD3
+ T细胞中CRTAM
+细胞频率显著低于健康对照。用BCG、*M. smegmatis*和Mtb H37Rv裂解液刺激健康供者PBMCs后，均能显著诱导CRTAM的表达，其中以CD8
+ T细胞中的表达增加尤为明显。
3. **T细胞中的CRTAM表达可调节抗Mtb效应功能，从而抑制巨噬细胞内的Mtb生长**
将抗CD3/CD28刺激后分选的CRTAM
+和CRTAM
- CD3
+ T细胞分别与H37Rv感染的hMDMs或BCG感染的THP-1细胞共培养，结果显示，与CRTAM
- T细胞组相比，CRTAM
+ T细胞共培养组的H37Rv细菌载量降低约25%，BCG CFU降低约50%。通过慢病毒在CD3
+ T细胞中过表达或敲低CRTAM后发现，过表达CRTAM使细菌计数减少约30%，而敲低CRTAM则导致H37Rv CFU显著增加。使用激动性抗CRTAM抗体处理PBMCs或CD3
+ T细胞，可使其抑制H37Rv生长的能力增强约35%，并伴随产生颗粒溶素、穿孔素和IL-17A的细胞频率明显增加。此外，外源性重组人CRTAM蛋白的处理也能增强T细胞产生IFN-γ和TNF-α的能力，并减少巨噬细胞内的分枝杆菌载量，但在无细胞体系中重组CRTAM不直接抑制细菌生长，表明其作用依赖于宿主细胞。
4. **CRTAM
+ T细胞具有高水平的抗结核细胞因子产生**
对分选的CD3
+CRTAM
+和CD3
+CRTAM
- T细胞进行RNA测序，结果显示CRTAM
+ T细胞富集了NK细胞介导的细胞毒性、趋化因子信号和PI3K-AKT通路等相关基因。流式细胞术分析表明，来自健康供者和ATB患者的CRTAM
+CD3
+ T细胞，其IFN-γ、IL-17A、CD107a、穿孔素和颗粒酶B的产生细胞频率均显著高于CRTAM
-对应细胞。在CD8
+ T细胞亚群中同样观察到类似趋势。相关分析确认CRTAM表达水平与IFN-γ和穿孔素的表达呈正相关。
5. ***Crtam*缺陷小鼠对Mtb感染更易感**
在体内实验中，BCG静脉感染2周后，小鼠脾脏淋巴细胞（特别是CD8
+ T细胞）上的Crtam表达水平显著升高约1.6倍。与WT小鼠相比，*Crtam*-/-小鼠在BCG感染4周后，其肺脏和脾脏的细菌载量显著更高。在毒力更强的Mtb H37Rv鼻内感染模型中，*Crtam*-/-小鼠同样表现出更高的肺脏和脾脏细菌CFU，并伴有更严重的肺部炎症损伤和组织病理学评分。体外共培养实验显示，与WT小鼠CD3
+ T细胞相比，*Crtam*-/-小鼠的CD3
+ T细胞与Mtb感染的RAW264.7巨噬细胞共培养后，细菌载量约高1.3倍。
6. **外源性CRTAM给药赋予宿主保护性免疫**
在治疗实验中，与PBS对照组相比，在Mtb H37Rv感染前后给予重组小鼠CRTAM（rmCRTAM）蛋白的WT小鼠，其脾脏中的Mtb载量显著降低，且肺部的病理损伤（包括炎症面积和组织病理学评分）得到明显缓解。
**四、总结与讨论**
研究结果表明，CRTAM是一个与抗分枝杆菌保护性效应反应相关的关键分子，尤其在活化的CD8
+ T细胞中发挥重要作用。CRTAM的表达与增强的效应分子产生和改善的胞内分枝杆菌生长控制相关，而*Crtam*基因缺陷则增加了小鼠对感染的易感性。此外，外源性重组CRTAM蛋白的给药能在体内赋予小鼠针对Mtb感染的保护性免疫，这为CRTAM作为结核病免疫调节治疗靶点提供了初步的体内概念验证。讨论部分指出了研究的局限性，如部分实验的供者数量有限、CRTAM调节T细胞反应的精确细胞机制尚不完全明确，以及重组CRTAM在已确立的结核病中的治疗潜力及长期安全性仍需进一步探究。未来的研究需要纳入更大规模的纵向人群队列，开展更详细的机制分析和针对已确立感染的干预性研究，以进一步确立CRTAM在结核病中的预测、机制和转化意义。
**研究结论：** 总之，研究人员将CRTAM鉴定为一个与保护性抗分枝杆菌效应反应相关的分子，尤其是在活化的CD8
+ T细胞中。CRTAM的表达和刺激与增强的效应分子产生和改善的胞内分枝杆菌生长控制相关，而*Crtam*缺陷则增加了小鼠对感染的易感性。此外，研究提供了初步的体内概念验证证据，表明外源性重组CRTAM可以影响Mtb感染过程中的感染相关结局。这些发现支持将CRTAM作为一种候选的免疫调节分子进行进一步研究，而其潜在的下游信号机制以及对已确立结核病的潜在治疗效果仍有待确定。
