垂直凝视保持的胆碱能调制：大鼠Cajal间质核（INC）神经元胆碱能输入来源及电流反应特性

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Cholinergic input origins and current response properties in rat interstitial nucleus of Cajal neurons

　　

Cajal间质核（interstitial nucleus of Cajal，INC）和舌下前置核（prepositus hypoglossi nucleus，PHN）分别作为垂直和水平凝视保持的神经积分器。既往研究提示，来自中脑脑桥被盖的胆碱能输入调制水平积分器的功能；然而，垂直积分器中胆碱能输入的调制特性和来源仍不清楚。本研究在大鼠中探究INC神经元的胆碱能反应及胆碱能输入的解剖来源。脑干切片全细胞记录显示，局部施加乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）可在INC神经元诱导内向电流，该电流由烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic ACh receptors，nAChRs）和毒蕈碱型乙酰胆碱受体（muscarinic ACh receptors，mAChRs）共同介导。尽管PHN神经元的电流反应主要由nAChRs介导，但INC神经元中nAChRs和mAChRs的参与比例随神经元类型而异。利用胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）-tdTomato转基因大鼠进行腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）逆行示踪显示，INC胆碱能输入的主要来源为内侧前庭核（medial vestibular nucleus，MVN）尾侧大细胞区（MVeMC）。此外，PHN的主要胆碱能输入起源于尾侧MVeMC和尾侧PHN本身。这些结果表明，垂直神经积分器与水平积分器共享尾侧MVN这一共同胆碱能来源，尽管nAChRs和mAChRs的相对贡献在INC和PHN神经元之间未必共享。这些发现提示胆碱能调制在垂直和水平凝视保持中的潜在作用。

研究背景与问题：凝视保持信号主要由眼动神经积分器产生，其将与时相眼或头速度成比例的瞬态爆发信号转换为与眼位成比例的持续信号。PHN和INC分别参与水平和垂直凝视保持的神经积分。既往对PHN的研究提示胆碱能输入参与积分器功能，mAChRs和nAChRs均被报道参与其中；中脑脑桥被盖曾被提示为PHN胆碱能输入来源。相比之下，PPTg和LDTg至INC的胆碱能投射未见报道，但ChAT-tdTomato大鼠INC中可见tdTomato表达轴纤维，提示INC神经元也受胆碱能传递调制，然而尚无INC神经元胆碱能效应的报道。因此，研究人员提出三个问题：INC神经元是否对ACh表现电流反应；这些反应是否如PHN一样主要由nAChRs介导，或依细胞类型表现不同受体依赖；INC胆碱能输入的主要来源是什么，与PHN有何差异。研究目的在于明确垂直整合器的胆碱能反应特性及其输入来源，并与水平整合器比较。

研究人员开展的研究与结论：研究人员采用大鼠脑干切片全细胞记录和ChAT-tdTomato转基因大鼠逆行AAV示踪，发现ACh在INC神经元诱导兴奋性内向电流，并由nAChRs和mAChRs共同介导，且受体相对贡献具细胞类型依赖性；INC胆碱能输入主要来自尾侧MVeMC，而PHN主要来自尾侧MVeMC和尾侧PHN本身。该研究提示垂直与水平神经积分器共享尾侧MVN胆碱能来源，但内部受体机制不同，为理解三维凝视保持的胆碱能调制提供了解剖与生理基础。

关键技术方法（≤250字）：电生理采用脑干切片全细胞膜片钳记录，局部压力喷射ACh，并用mAChR和nAChR拮抗剂分析电流幅度与电荷转移；解剖采用ChAT-tdTomato转基因大鼠，将逆行AAVrg-hSyn-EGFP单侧注入INC或PHN，3周后组织学计数EGFP/tdTomato双标神经元。样本来源：电生理数据来自8只VGAT-Venus转基因大鼠（出生后18–21 d）；解剖数据来自6只ChAT-tdTomato转基因大鼠（10–12周龄雄性）；PHN比较采用既往研究数据，并新增2只VGAT-Venus×ChAT-tdTomato双转基因子代数据验证记录条件一致性。

结果1：INC神经元对乙酰胆碱的电流反应。通过脑干切片全细胞记录，所有测试的INC神经元（n=38）均对局部施加ACh表现内向电流。以膜电容标准化的电流幅度和电荷转移均小于既往记录的PHN神经元。进一步按细胞类型比较，INC谷氨酸能神经元的幅度和电荷转移显著小于PHN谷氨酸能神经元；INC抑制性神经元的幅度显著小于PHN抑制性神经元，但电荷转移无显著差异。为确认既往记录条件与本研究一致，研究人员用当前装置记录额外PHN数据集，谷氨酸能和抑制性神经元在幅度与电荷转移上均与既往数据集无显著差异，从而支持INC与既往PHN数据的直接比较。通过mAChR拮抗剂阿托品和nAChR拮抗剂美加明分析，谷氨酸能INC神经元中nAChR介导的电流和电荷百分比与mAChR介导者无显著差异；抑制性INC神经元中nAChR介导的电流和电荷百分比显著大于mAChR介导者；PHN谷氨酸能和抑制性神经元中nAChR介导的电流和电荷百分比均显著大于mAChR介导者。结论为INC神经元对ACh产生内向电流，nAChRs和mAChRs共同参与，且相对贡献依INC神经元类型而异，与PHN的表现不完全相同。

结果2：INC胆碱能输入的主要来源。ChAT-tdTomato大鼠INC中可见tdTomato表达轴纤维。将逆行AAVrg-hSyn-EGFP单侧注入INC后，PPTg和LDTg中仅见少量EGFP单阳性神经元，未见EGFP/tdTomato双标神经元；双标神经元主要位于MVN尾侧、尤其MVeMC，最高密度约在bregma ?12.24至?12.60 mm，同侧为每3张切片14±4个、对侧15±3个；MVePC和PHN中未见双标神经元。结论为INC主要接受来自尾侧MVeMC的胆碱能投射。为比较垂直与水平整合器胆碱能输入来源，研究人员将AAVrg注入PHN，病毒扩散波及邻近MVN；PPTg和LDTg未见双标神经元；对侧MVN的MVeMC和尾侧PHN可见双标神经元（对侧MVN每3张切片6±3个，对侧PHN 2±2个），最高密度约在bregma ?11.64至?12.24 mm；INC和PnO中可见逆行标记神经元，验证AAV逆行转运成功。结论为PHN胆碱能输入主要来自尾侧MVN和尾侧PHN本身，而非PPTg或LDTg。

讨论总结：本研究显示ACh对INC神经元产生兴奋性内向电流，提示胆碱能输入对垂直凝视保持神经积分器具有兴奋性调制作用；nAChRs和mAChRs均参与，且具有细胞类型特异性受体依赖，区别于PHN。基于mAChR可提供持续去极化驱动并使PHN神经元在瞬态爆发输入后维持放电的既往认识，INC中mAChR介导的内向电流可能具有类似持续驱动作用；同时nAChRs也参与ACh反应，提示垂直凝视保持所需的持续活动可能依赖nAChRs和mAChRs共同激活。研究未检测这些反应是否增强放电率或持续放电，因此仅在膜电流水平证明胆碱能调制，未直接建立胆碱能信号与凝视保持的因果关系。INC中ACh诱导电流幅度和电荷转移小于PHN，可能反映ACh受体密度较低；两核团中谷氨酸能和抑制性神经元均被ACh激活，提示胆碱能输入同时调制兴奋性和抑制性元素。INC中抑制性神经元nAChR贡献显著大于mAChR，而谷氨酸能神经元二者无显著差异；PHN两类神经元均以nAChR贡献为主。该目标核团特异性差异与两核团局部兴奋网络采用不同受体机制（分别主要为NMDA受体和Ca²⁺通透AMPA受体）的既往发现相似，提示两整合器的基础回路与调制系统均具不同受体依赖。逆行示踪显示INC胆碱能来源为MVN尾侧MVeMC，未见于嘴侧；MVN处理前庭信号，嘴侧MVN接受初级前庭传入并投射至眼动核团参与前庭眼反射，尾侧MVN尤其MVeMC与vestibulocerebellum相互连接，参与优化凝视稳定。由于胆碱能机制参与凝视保持所需持续神经活动，来自MVeMC的特异性胆碱能输入可能依据与小脑环路相关的前庭信息驱动整合器持续放电。PHN胆碱能来源为尾侧MVN和PHN本身，这与既往将中脑脑桥被盖视为PHN主要胆碱能来源的假设不同；尽管有解剖连接报道，但无直接证据表明这些投射为胆碱能。中脑脑桥被盖参与状态依赖觉醒、睡眠-觉醒周期和注意过程；由于局灶病毒注射未覆盖整个PHN，不能完全排除此类觉醒相关胆碱能输入。尾侧MVN作为共同胆碱能来源，提示PHN胆碱能调制传递与前庭信息紧密耦合的信号；MVeMC至垂直和水平神经整合器的共享胆碱能投射为协调三维凝视保持提供了解剖和生理基础。方法学上，荧光葡聚糖示踪因点状信号难以与穿过mlf的纤维区分，故采用可提供弥漫胞质荧光的AAVrg-EGFP；病毒嗜性偏倚不能完全排除，但尾侧MVeMC胆碱能神经元成功标记使LDTg和PPTg无标记不太可能仅由该因素解释。INC注射局部扩散至邻近中脑结构，对侧荧光反映EGFP标记轴突跨后连合而非直接病毒扩散，且LDTg和PPTg未见双标。药理学上，1 mM ACh局部喷射在到达记录神经元前被显著稀释，不能复制内源性胆碱能传递的复杂时空动态，方案目的是在标准化饱和条件下评估受体介导反应能力；体细胞电压钳存在空间钳制限制，远程树突电导可能被低估，但喷射管靠近胞体预计主要限制ACh作用于胞体和近端树突，可能降低空间钳制伪差对INC与PHN组间相对比较的影响，解释绝对幅度时仍需谨慎。切片制备限制亦需考虑，在体条件下背景突触输入和神经调制存在时，ACh诱导电流实际幅度及nAChR/mAChR相对贡献应谨慎解释；眼动神经积分器受快速突触传递与胆碱能、去甲肾上腺素能、5-羟色胺能、嘌呤能等多重调制通路复杂相互作用调控，本研究聚焦胆碱能调控，澄清了神经整合器神经元内在胆碱能特性，为理解复杂神经调制相互作用提供基础。研究结论（译）：本研究的电生理和解剖数据表明，垂直和水平神经整合器均接受起源于尾侧MVN的胆碱能调制；然而，为处理这些信号，它们利用不同的内部机制，例如细胞类型特异性受体依赖。因此，来自尾侧MVN的共同调制来源可能调制参与三维凝视保持的各整合器内在网络。