乳腺上皮–间充质干细胞互作及mTORC1代谢调控：机制、跨物种比较与转化前景

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Epithelial and mesenchymal stem cell biology in the mammary gland: mechanisms, comparative insights, and translational perspectives

　　

乳腺干细胞生物学为组织再生、乳腺发育、代谢适应、炎症及泌乳功能之间提供了重要联系。本综述考察乳腺中的上皮干细胞（epithelial stem cells，EpSCs）与间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）群体，重点阐述二者在组织微环境中的互补作用及相互作用。综合小鼠、人类和牛研究证据，突出与乳腺功能和疾病相关的共同生物学原则及物种特异性特征。特别关注乳腺微环境（mammary niche）中上皮、基质、免疫、内分泌和代谢组分之间的动态互作，以及这些互作如何调控干细胞活性和组织稳态。代谢调控以机制性雷帕霉素靶蛋白复合物1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）在乳腺上皮干细胞调控中的作用为例说明。乳腺证据表明，间歇性mTORC1抑制可增强干细胞活性，并可能影响乳腺发育、泌乳能力及泌乳持久性，但其对整体动物产奶量的影响尚待确立。间充质干细胞既被视为乳腺驻留基质群体，也被视为上皮–基质通讯的潜在外部介导者。它们可能整合代谢、内分泌和炎症信号，并促进组织稳态与修复。本综述进一步在牛乳房炎（bovine mastitis）背景下讨论其治疗潜力；其中基于间充质干细胞的策略仍处于实验阶段，并可能通过旁分泌、免疫调节及实验支持的抗菌机制发挥作用。总体而言，现有证据支持上皮与间充质干细胞群体在乳腺发育、再生和组织维持中具有不同但互补的作用，但其身份及功能意义在不同物种间仍未完全阐明。明确这些群体及其相互作用，或可为人类乳腺健康和再生的干细胞策略以及农场动物健康和生产提供信息。

1 引言：乳腺生物学与干细胞群体（Introduction: mammary gland biology and stem-cell populations）
乳腺为专门外分泌器官，泌乳受内分泌、代谢和免疫信号整合调控；上皮细胞执行乳汁合成与分泌，间质和免疫成分经结构支持、免疫调节及旁分泌塑造微环境。乳腺重塑依赖上皮更新与再生，干细胞位于细胞层级顶端。胚胎前体产生组织特异性上皮干细胞（epithelial stem cells，EpSCs）和间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），形成成体微环境（mammary niche）。EpSCs再生乳腺实质并产生基底/肌上皮和腔上皮谱系；乳腺实质嵌入种属特异性纤维–脂肪基质，驻留MSCs可分化为支持细胞并发挥调节和免疫调节作用。与EpSCs相比，乳腺MSC研究较少，且需区分驻留与外源MSC。本综述比较鼠、人、牛证据，讨论两类群体特性、微环境互作、物种特征及转化前景。

2 乳腺EpSC生物学：来自小鼠模型的概念性认识（Mammary EpSC biology: conceptual lessons from murine models）
小鼠乳腺在妊娠、泌乳和退化中广泛重塑，再生由稀少EpSCs和更多谱系偏向祖细胞支持。功能鉴定依赖移植入清除脂肪垫；富集基底标志物（如CD49f^highCD24^med或CD29^highCD24⁺）的少量细胞可重建功能腺体。多种标志物及乳腺球形成支持表型和功能不同的EpSC群体。末端芽（terminal end bud，TEB）帽细胞层含约260个EpSCs，其中至少35个干/祖细胞参与导管形态发生。成体EpSC多谱系潜能仍有争议：移植支持双潜能，而完整组织谱系追踪显示基底和腔上皮主要由谱系限制性干/祖细胞维持；单细胞和空间谱系追踪揭示基底区异质性，CD34^?CD200⁺细胞具较强长期再生能力，Bcl11b⁺细胞为稀有长寿双潜能干细胞，Sema3a⁺细胞多为快速反应单能祖细胞。EpSCs多缺乏经典激素受体，经Wnt、Notch、EGFR、IGF和RANK等旁分泌信号响应系统信号，微环境调控其命运；但确定性标志物仍缺乏。

3 人类乳腺上皮干/祖细胞：从功能研究到单细胞分析及乳腺癌（Human mammary epithelial stem/progenitor cells: from functional studies to single-cell analysis and breast cancer）
人研究依赖标志物分选、克隆形成、类器官和异种移植，不能直接证明完整人乳腺中的干细胞身份，且无法遗传谱系追踪。移植可显示候选群体再生和多谱系潜能，但改变微环境；人上皮在鼠脂肪垫定植需人基质，凸显上皮–基质互作。单细胞RNA测序揭示基底和腔上皮多样性、ALDH⁺及CD44⁺CD24^?群体异质性和连续分化状态；大规模单细胞和空间图谱进一步支持细胞状态可塑性而非单一标志物界定的离散群体。类器官显示基底/干细胞富集和腔祖群体可生成成熟谱系。乳汁来源细胞以腔上皮为主并含腔祖样转录特征，但功能证据有限。乳腺癌中Lin^?CD44⁺CD24^?/low细胞可在免疫缺陷小鼠中启动肿瘤，但细胞起源具亚型差异。总体而言，人研究拓展了小鼠框架，但定义群体对正常维持和癌变的贡献仍未完全解决。

4 牛乳腺EpSC生物学：与小鼠系统比较下的组织原则、微环境限制及情境依赖性读出（Bovine mammary EpSC biology: organizational principles, microenvironmental constraints and context-dependent readouts compared with murine systems）
牛是主要乳源，但缺乏体内谱系追踪，牛EpSC只能操作性地定义为具持续再生和/或多谱系能力证据的上皮群体。早期小、淡染、高增殖细胞多代表活跃祖细胞；BrdU标记保留发现少量慢周期候选细胞。ALDH高活性细胞具克隆形成等早期祖/干样特性；CD24^medCD49f^pos细胞被提出为EpSC富集群体，可产生基底和腔上皮祖细胞，但功能验证不如小鼠确定。牛EpSC强依赖微环境：异种移植可形成双层上皮结构但多呈球形、不能导管延伸；预置牛基质可部分挽救并改善导管样结构，乳腺实质–基质界面“close stroma”支持植入和导管生长。牛EpSC分化潜能、生理周期动态及奶源细胞干性仍受方法限制；单细胞/单核转录组解析了腔分泌、激素反应腔上皮和基底/肌上皮群体，但不直接证明干性。总体显示牛EpSC具层级性、异质性和微环境强约束，实验可处理性与生理相关性存在权衡。

4.1 调控牛乳腺EpSC富集群体自我更新与扩增的实验策略（Experimental strategies to modulate self-renewal and expansion of bovine mammary EpSC-enriched populations）
与肿瘤靶向EpSC相反，牛研究旨在扩增EpSC以支持上皮更新、维持乳腺功能和提高产奶。黄嘌呤核苷曾增加标记保留细胞和端粒酶活性，但缺乏干细胞池扩增功能证据，后续未见一致克隆形成、标志物或再生增强，并见延迟性增殖抑制。研究转向mTOR代谢调控：mTORC1整合AMPK、氨基酸和PI3K–AKT信号；热量限制（calorie restriction，CR）可经微环境降低mTORC1活性并增强干细胞自我更新，乳腺中CR增加移植定植和乳腺球形成、抑制分化标志物，并涉及BST-1。持续雷帕霉素抑制蛋白合成，而间歇/振荡抑制在小鼠中增加干细胞分数和导管生长，在牛乳腺植入中增强上皮再生和乳蛋白基因表达。犊牛“隔日给药”实现约50% mTORC1抑制，延迟但持久增强自我更新，体外上皮增殖约2.6倍、体内约31%，乳蛋白基因表达最高约6倍；效应与基线产乳蛋白潜力负相关，提示生理上限。该策略仍为实验性，rapamycin未完全复现CR的BST-1/cADPR通路，巨噬细胞CSF1信号和M2极化参与微环境整合；对实际产奶量、泌乳持久性、动物健康和长期安全尚需验证。

4.2 将基于雷帕霉素的mTOR调控转化为提高牛产奶量的限制（Constraints on translating rapamycin-based mTOR modulation to improved milk production in cattle）
营养调控mTOR虽可行，但在生产条件下难精确控制，难复现实验所需时空动态。药理mTOR抑制具自噬、代谢、生长和寿命等多效性；持续抑制损害蛋白合成和上皮功能，间歇调控的最佳时机、持续时间、幅度及治疗窗尚未确定。雷帕霉素为半衰期约69 h的大环内酯免疫抑制剂，用于食品动物需评估系统暴露、牛奶和可食组织最高残留限量（maximum residue limits，MRLs）及休药期，即使乳内局部给药也不能排除系统吸收。纳米颗粒或缓释水凝胶可能降低系统暴露，但剂量动态控制和残留问题仍未解决。因此，该策略仍是实验性干预，需在泌乳牛中证明对产奶量或泌乳持久性的效应，并优化时机、剂量和递送，同时评估系统暴露、动物健康、残留和长期效应。

5 间充质干细胞：起源、功能特性、乳腺基质特化及广泛农业应用（Mesenchymal stem cells: origin, functional properties, mammary stromal specialization and broad agricultural applications）
MSCs最初作为骨髓中支持造血的基质细胞被发现，为塑料黏附、纺锤形、中胚层来源且与造血细胞不同的异质群体；可从脂肪、脐带、胎盘、皮肤和牙髓等分离。经典表型为CD73、CD90、CD105阳性并缺乏CD45、CD34、CD14和HLA-DR。MSCs具成脂、成肌和成纤维等多向分化潜能，涉及TGF-β/BMP、Wnt/β-catenin、MAPK、PI3K/Akt和Notch通路；并具免疫调节作用，抑制T/B细胞、抑制树突状细胞成熟、促进M2巨噬细胞极化，NF-κB信号参与迁移和分化调控；还通过PGE2和cathelicidin LL-37等表现抗菌活性。乳腺中须区分驻留内源群体与外源扩增后给药群体；二者来源、表型和体内行为不同，不可互换。

5.1 乳腺内源性间充质干细胞群体（Endogenous mesenchymal stem cell populations in the mammary gland）
乳腺内源间充质干细胞活性应置于局部维持的基质区室中理解，包括驻留间充质祖/干样细胞及其分化为成纤维细胞、脂肪细胞、肌源性前体、血管周细胞和产生细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的群体，共同构成EpSC微环境的结构和信号基础。这些驻留群体虽与骨髓或脐带MSC有表型/功能相似性，但在完整乳腺中的发育关系和干性未必等同。骨髓或胎儿来源MSC可在损伤、炎症或肿瘤发生中归巢至乳腺，但对完整腺体贡献似乎有限；乳腺基质微环境调节主要来自驻留基质群体及其分化后代。分化基质细胞通过旁分泌、ECM重塑、机械感应及激素/代谢反应调节生长因子、细胞因子和基质信号，影响EpSC维持、增殖和分化。CR经基质CSF-1信号影响乳腺干细胞活性，说明上皮再生依赖EpSC内在特性与特化基质微环境互作；牛乳腺虽富基质，但很少作为祖/干细胞来源，可能因其驻留间充质祖细胞为特化微环境细胞。

5.2 外源性MSCs：实验与农业应用（Exogenous MSCs: experimental and agricultural applications）
外源MSCs在动物生产中主要因其再生、免疫调节和营养支持特性受关注，应用超出乳腺，包括骨关节损伤修复、酮病等代谢紊乱及培养肉生产细胞平台。猪、羊和牛来源MSCs已被分离、表征并建立体外分化和免疫表型方案；大规模转化受安全 concerns、肌源性效率低于成脂、多组织整合、培养基成本和细胞周期/分化效率限制。乳腺中外源MSC作为实验干预用于组织修复、炎症和上皮再生；其治疗活性多由旁分泌、免疫调节、细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）或与驻留基质/上皮互作介导，而非稳定植入或分化为乳腺上皮。外源MSC主要用于改变组织环境，不应与内源驻留群体生理功能混同。

5.3 乳腺中MSC–上皮细胞交互：机制基础、致癌风险及与牛乳腺生物学的相关性（MSC–epithelial crosstalk in the mammary gland: mechanistic basis, oncogenic risk, and relevance to bovine mammary biology）
乳腺中EpSCs位于基底/肌上皮区室，受基底膜及邻近上皮、间充质和造血细胞信号调控，并通过微环境整合激素和代谢信号；间充质干/祖群体主要位于基质和血管周区室。近期证据显示PDGFRα⁺小鼠乳腺间充质祖细胞可经间质–上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）贡献腔上皮和基底上皮谱系，提示情境依赖可塑性。内源与外源MSC不可互换；外源MSC长期植入有限，主要经旁分泌和EVs发挥作用。MSC–上皮通讯涉及TGF-β、HGF、IL-6、CCL5及ECM重塑酶，MSC来源EVs可转移miRNA、蛋白和脂质，影响上皮增殖、血管生成、脂生成和炎症。上皮–间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）是可逆程序，其与干性关系高度依赖情境；MSC可经TGF-β1等诱导EMT并涉及ZEB/miR-200轴。乳腺癌中EMT相关特征与干性、治疗抵抗和转移相关；MSC可被肿瘤招募并经CCL5等增强转移潜能，或获得癌相关成纤维细胞样表型。人乳腺重建中传统脂肪移植、SVF富集脂肪移植、细胞辅助脂肪移植（cell-assisted lipotransfer，CAL）及培养扩增脂肪来源干细胞（adipose-derived stromal/stem cells，ADSCs）应区别评估，肿瘤安全性不能直接外推。牛乳腺恶性肿瘤罕见，乳房炎炎症可经TGF-β1/Smad和NF-κB诱导EMT样改变和纤维化，但其种属普遍意义未确立；外源MSC治疗潜力与肿瘤风险需按具体细胞干预和操作程度评估。

5.4 基于MSC的牛乳房炎策略：机制基础与治疗潜力（MSC-based approaches for bovine mastitis: mechanistic basis and therapeutic potential）
牛乳房炎是常见且经济重要的乳腺炎症，常以体细胞计数（somatic cell count，SCC）升高提示，并伴产奶下降、生育力受损和淘汰风险增加。抗生素仍是慢性感染尤其金黄色葡萄球菌感染的标准治疗，但难治病例促使免疫调节策略和MSC实验研究。荷斯坦牛中，同种异体骨髓或脂肪来源MSC经乳内或乳内联合系统给药可降低金黄色葡萄球菌载量和乳SCC；小鼠牛乳房炎模型显示系统MSC输注降低TNFα、CXCL2和ICAM-1并增加IL-10，且未检测到乳腺植入，提示治疗效应主要经旁分泌而非直接组织整合。MSC分泌IL-10、TGF-β和PGE2，调节中性粒细胞和巨噬细胞，促进病原清除并限制TNF-α、IL-1β、IL-6过度产生，还支持CD4⁺调节性T细胞和M2巨噬细胞扩增。MSC还通过抗菌肽和EVs（如miR-146a、miR-21）发挥抗菌和免疫调节作用，并促进成纤维细胞产生I/III型胶原和弹性蛋白、抑制肌成纤维细胞分化，从而限制纤维化。转化挑战包括系统递送的肺滞留和乳内解剖大乳池对均匀分布的限制；水凝胶载体或无细胞MSC分泌组等策略仍处实验阶段，疗效、安全性、细胞来源、剂量、处理条件和递送方法均需验证。

6 讨论（Discussion）
现有证据支持乳腺干细胞功能并非孤立细胞群体的固有属性，而是上皮层级在特化且动态组织环境中涌现的性质。EpSCs参与上皮更新和谱系产生，MSCs及其他基质群体塑造信号、ECM、代谢和炎症环境。小鼠谱系追踪挑战单一永久双潜能干细胞概念，而移植等功能实验证明部分上皮细胞可生成腔和基底谱系；但标志物、移植、谱系追踪、类器官及单细胞/空间分析各自仅回答不同维度并具局限，干细胞身份应综合表型、再生能力、谱系输出、定位和生理反应判断。牛乳腺提供长期泌乳的生理背景，但谱系关系分辨率有限，候选EpSC群体变化不能自动解释为功能能力变化。mTOR研究说明代谢调控依赖通路活性、时机、组织结构和微环境，持续与间歇抑制后果不同；干细胞活性增加不等于无限上皮扩增或产奶量成比例增加，组织架构、代谢供给和生物合成能力构成生理约束。CR比较还提示代谢信息经上皮、基质和免疫区室整合，巨噬细胞和基质信号参与其中。乳腺健康是互补转化维度，EMT及相关变化应视为受基质信号和组织重塑影响的情境依赖上皮可塑性。MSC治疗潜力更多依赖旁分泌、免疫调节、ECM和血管效应而非持久替代；须区分驻留与外源MSC，不能以给药MSC行为定义内源群体。转化关键是将干细胞活性与乳腺功能、健康和生产中的可测结局（上皮再生、泌乳反应、乳腺完整性、炎症损伤恢复和生产性能）联系起来，而非仅看干细胞丰度。未来需整合谱系/功能分辨与单细胞、空间、代谢和炎症分析，以区分标志变化与持久功能变化。