FCN1+巨噬细胞相关SEMA3C–NRP1轴与RA-ILD成纤维细胞重编程的关联

《Frontiers in Immunology》：An FCN1+ macrophage-associated SEMA3C–NRP1 axis is linked to fibroblast reprogramming in RA-ILD

　　

摘要

引言：类风湿关节炎相关间质性肺病（rheumatoid arthritis–associated interstitial lung disease, RA-ILD）是类风湿关节炎的重要关节外并发症，也是发病和死亡的主要原因。与特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）不同，RA-ILD发生在全身免疫激活的背景下，但将炎症与成纤维细胞状态变化联系起来的细胞基础仍不完全清楚。

方法：研究人员对健康对照者、RA-ILD患者和IPF患者的肺组织进行了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），并辅以空间验证和体外实验。

结果：在该队列中，RA-ILD肺的巨噬细胞区室中FCN1⁺炎症巨噬细胞的比例增加，而IPF肺以SPP1⁺巨噬细胞为主。轨迹分析和细胞间通讯分析确定了RA-ILD富集的基质成纤维细胞向CXCR4⁺脂成纤维细胞程序，以及炎症巨噬细胞群与成纤维细胞之间预测的SEMA3C–NRP1相互作用；这些模式在所分析的IPF或健康对照样本中均未检测到。多重免疫荧光显示，在纤维化区域内，巨噬细胞相关的SEMA3C信号与NRP1⁺成纤维细胞在空间上邻近。来自RA-ILD肺的流式分选炎症单核细胞/巨噬细胞富集群具有较高的上清SEMA3C水平，并与MRC-5成纤维细胞标志物从EBF1/PDGFRA向APOE/CXCR4的转变相关。重组SEMA3C可重现这种标志物定义的转变，而药理学NRP1抑制可减弱该转变；正交的THP-1过表达模型产生了一致的结果。

讨论：这些数据支持炎症巨噬细胞–SEMA3C–NRP1轴与所研究RA-ILD样本中成纤维细胞状态重塑之间的关联。由于RA-ILD队列规模较小，且未纳入其他CTD-ILD亚型，因此这些发现不应被解释为确立了RA-ILD特异性或完全的促纤维化功能表型。

类风湿关节炎相关间质性肺病（RA-ILD）是类风湿关节炎的重要关节外并发症，也是患者发病和死亡的主要原因。与特发性肺纤维化（IPF）不同，RA-ILD发生在全身免疫激活的背景下，但炎症如何驱动成纤维细胞状态改变的细胞基础仍不清楚。巨噬细胞和成纤维细胞是组织损伤、修复和纤维化重塑的核心调节细胞；单细胞研究已揭示肺巨噬细胞亚群具有显著异质性，例如SPP1⁺巨噬细胞与IPF纤维化重塑密切相关，FABP4⁺巨噬细胞富集于健康肺，FCN1⁺巨噬细胞则是单核细胞来源的炎症亚群。然而，RA-ILD中特定巨噬细胞亚群是否驱动成纤维细胞活化，以及它们如何与产生胶原的成纤维细胞相互作用，仍不清楚。Semaphorin 3C（SEMA3C）是第3类信号蛋白家族的分泌型成员，通过含神经毡蛋白（neuropilin）和丛蛋白（plexin）的受体复合物调控细胞迁移和细胞间通讯，并在肝纤维化中增强TGF-β依赖性肌成纤维细胞活化，但其是否介导RA-ILD中炎症巨噬细胞与成纤维细胞之间的通讯仍是未知数。为此，研究人员开展了本研究。

研究人员对健康对照（HC，n=4）、RA-ILD（n=3）和IPF（n=5）患者的肺组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），结合空间验证和体外实验，系统分析了巨噬细胞与成纤维细胞的亚群构成、分化轨迹和细胞间通讯。研究发现，RA-ILD肺中FCN1⁺炎症巨噬细胞比例明显增加，IPF肺则以SPP1⁺巨噬细胞为主；RA-ILD中基质成纤维细胞向CXCR4⁺脂成纤维细胞方向分化，并预测了炎症巨噬细胞与成纤维细胞之间的SEMA3C–NRP1相互作用。体外实验进一步支持SEMA3C–NRP1轴可诱导成纤维细胞标志物从EBF1/PDGFRA向APOE/CXCR4的转变。该研究为理解RA-ILD中炎症-纤维化串扰提供了候选分子通路，但需在更大样本和更多CTD-ILD亚型中验证其疾病特异性。

本研究的关键技术方法包括：样本来自中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准（No. 2022052701006）的肺组织，分为HC（n=4）、RA-ILD（n=3）、IPF（n=5）三组。主要方法包括：基于10x Genomics平台的scRNA-seq，使用Seurat、Harmony和Scrublet进行数据质控与整合；Monocle2进行细胞轨迹分析；CellChat推断细胞间配体-受体相互作用；多重免疫荧光（TSA技术）和免疫组化进行空间定位验证；体外实验中，从RA-ILD肺组织分选CD45⁺CD11b⁺HLA-DR⁺CD64⁺CD14⁺CCR2⁺炎症单核/巨噬细胞富集群，与MRC-5成纤维细胞进行Transwell共培养，同时利用THP-1细胞慢病毒过表达SEMA3C、重组SEMA3C刺激及NRP1拮抗剂处理，结合ELISA、免疫荧光和CCK-8检测功能指标。

研究结果如下：单细胞测序揭示了所研究RA-ILD队列中富集炎症特征的细胞景观。通过scRNA-seq和组织学染色，RA-ILD肺中巨噬细胞比例较HC升高（17%对12.8%），且炎症相关功能评分显著高于HC和IPF组。FCN1⁺炎症巨噬细胞在所研究RA-ILD肺中富集。聚类和轨迹分析显示，FCN1⁺巨噬细胞占RA-ILD巨噬细胞区室的36%，炎症评分最高；免疫荧光显示FCN1与CD68在胶原丰富区域共定位，而IPF以SPP1⁺巨噬细胞为主。基质成纤维细胞与RA-ILD中CXCR4⁺炎症相关脂成纤维细胞状态相关。成纤维细胞亚群分析表明，RA-ILD中CXCR4⁺脂成纤维细胞是最大亚群，Monocle2轨迹分析提示基质成纤维细胞向CXCR4⁺脂成纤维细胞分化；免疫荧光显示EBF1或APOE阳性成纤维细胞与FCN1阳性细胞在空间上邻近。RA-ILD富集的SEMA3C–NRP1信号模式将炎症巨噬细胞与基质成纤维细胞联系起来。CellChat分析在RA-ILD中预测了SEMA3C–NRP1相互作用，而IPF中以SPP1相关相互作用为主；多重免疫荧光显示SEMA3C与CD68/FCN1共定位，且NRP1阳性信号出现在胶原丰富区域附近。RA-ILD炎症单核/巨噬细胞富集群与APOE⁺CXCR4⁺成纤维细胞状态改变相关。分选的炎症髓系细胞FCN1信号较高，其上清SEMA3C浓度更高；与MRC-5共培养后，成纤维细胞EBF1/PDGFRA信号降低，APOE/CXCR4信号升高。外源性SEMA3C诱导标志物定义的成纤维细胞状态转变。重组SEMA3C处理MRC-5细胞后，EBF1和PDGFRA表达降低，APOE和CXCR4表达升高。NRP1抑制减弱SEMA3C相关的成纤维细胞标志物重编程。SEMA3C过表达的THP-1来源巨噬细胞与MRC-5共培养可产生上述标志物变化，而NRP1拮抗剂可减弱该变化。

在讨论部分，研究人员整合既往文献指出，SEMA3C在肝纤维化等疾病中参与TGF-β介导的肌成纤维细胞活化，并可调节免疫微环境。在本研究比较的RA-ILD、HC和IPF样本中，FCN1⁺巨噬细胞富集、巨噬细胞相关SEMA3C表达和NRP1⁺成纤维细胞反应共同表征了所分析的RA-ILD样本。但研究存在明确局限性：RA-ILD队列仅3例，缺乏其他CTD-ILD亚型对照；分选的炎症髓系细胞并非转录纯化的FCN1⁺群体；伪时间轨迹属于推断性排序而非谱系示踪；体外实验使用MRC-5胎儿肺成纤维细胞而非成人原代肺成纤维细胞；功能终点主要基于标志物变化，未检测胶原合成、α-SMA、基质收缩、迁移和增殖等，因此不能等同于完全促纤维化功能表型。研究结论可翻译为：总之，本研究确定了一个FCN1⁺炎症巨噬细胞相关的SEMA3C–NRP1信号模式，该模式与所检查的RA-ILD样本中的成纤维细胞状态重塑相关。由于队列规模和上述分析限制，该轴应被视为候选机制，需要在更大规模的独立RA-ILD和CTD-ILD队列以及成人原代肺成纤维细胞中进一步验证。