《Frontiers in Immunology》：Deoxyribonuclease DNASE1L3 promotes innate immunity against DNA virus infection by enhancing the cGAS-STING pathway
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脱氧核糖核酸酶（deoxyribonucleases）已知可清除自身DNA以抑制天然免疫应答并预防自身免疫病。脱氧核糖核酸酶如何应答DNA病毒感染仍不清楚。本研究中，HSV-1（herpes simplex virus 1，单纯疱疹病毒1型）感染显著上调并激活
脱氧核糖核酸酶（deoxyribonucleases）已知可清除自身DNA以抑制天然免疫应答并预防自身免疫病。脱氧核糖核酸酶如何应答DNA病毒感染仍不清楚。本研究中，HSV-1（herpes simplex virus 1，单纯疱疹病毒1型）感染显著上调并激活DNASE1L3。体外，DNASE1L3过表达上调I型干扰素（type I interferons）和促炎细胞因子的产生，增强IRF3（interferon regulatory factor 3，干扰素调节因子3）磷酸化，并抑制病毒复制；而DNASE1L3缺陷导致相反表型。体内，Dnase1l3敲除损害抗HSV-1天然免疫，导致小鼠死亡早发和生存率降低。机制上，DNASE1L3通过新机制增强cGAS（cyclic GMP-AMP synthase，环鸟苷酸-腺苷酸合成酶）-STING（stimulator of interferon genes，干扰素基因刺激因子）通路激活。一方面，DNASE1L3结合STING，增强其寡聚化和TBK1（TANK-binding kinase 1，TANK结合激酶1）募集，不依赖核酸酶活性。另一方面，DNASE1L3促进HMGB1（high-mobility group box 1，高迁移率族蛋白B1）和cGAS从染色质释放，依赖核酸酶活性，最终增强cGAS寡聚化和cGAMP（cyclic GMP-AMP，环鸟苷酸-腺苷酸）产生。本研究揭示DNASE1L3的新作用及协调对自身DNA和病毒DNA天然免疫应答的机制。
研究背景与问题：DNA天然免疫与自身免疫病、DNA病毒感染及肿瘤免疫密切相关，cGAS-STING通路激活在其中发挥关键作用。生理条件下，自身DNA需被清除或耐受，而微生物DNA激活天然免疫信号以对抗病原感染；染色质结合状态的cGAS无活性，但可被病毒感染再激活，提示不同生物过程对DNA差异应答存在结构基础，但协调机制尚待阐明。脱氧核糖核酸酶降解DNA是机体预防自身免疫病的重要方式，DNASE1L3具有核定位信号和C端结构域，可切割核小体及脂质体DNA；其突变或活性降低与系统性红斑狼疮和类风湿关节炎相关，Dnase1l3敲除小鼠可通过内体TLR7/9诱导B细胞分化和浆细胞样树突状细胞I型干扰素表达。然而，DNASE1L3是否及如何调控DNA病毒感染中的天然免疫尚不清楚。研究人员发现HSV-1感染上调并激活DNASE1L3，进而抑制HSV-1感染并提高小鼠生存；机制涉及胞质中结合STING促进其寡聚化和TBK1募集，以及核内依赖核酸酶活性促进cGAS、HMGB1和H1.2从染色质释放，增强cGAS寡聚化和cGAMP产生。该研究揭示DNASE1L3在抗DNA病毒天然免疫中的新作用，与其通过内体TLR7/9抑制自身DNA诱导自身免疫病的作用相反，提示空间定位决定其功能差异。
技术方法：采用CRISPR/Cas9构建的Dnase1l3
?/?（C57BL/6背景）与野生型（Wt）同品系小鼠，以及THP-1、HEK293T、L929、143B、Vero细胞和原代MEFs（mouse embryonic fibroblasts，小鼠胚胎成纤维细胞）、BMDMs（bone marrow-derived macrophages，骨髓来源巨噬细胞）。建立HSV-1细胞与小鼠感染模型；使用qRT-PCR、Western blotting、Co-IP（co-immunoprecipitation，免疫共沉淀）、SDD-AGE（semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis，半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳）、双荧光素酶报告基因、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验）、免疫荧光、亚细胞分级、DNase活性测定（143B基因组/核小体DNA为底物，Alu200/Alu76比值）、噬斑形成实验、质谱检测cGAMP及Kaplan–Meier生存分析。
研究结果：
3.1 DNASE1L3 upregulation by HSV-1 infection enhances innate immunity in vitro：通过HSV-1感染THP-1细胞裂解物的核酸酶活性检测、双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和噬斑实验，发现HSV-1感染增加细胞内核酸酶活性并一致上调DNASE1L3；DNASE1L3过表达最显著促进IFNB启动子、ISRE和NF-κB报告基因活性，增强IRF3磷酸化及IFNB、TNFA、IL6表达，并抑制HSV-1复制。
3.2 DNASE1L3 deficiency inhibits innate immunity against HSV-1 in vitro：通过THP-1敲低、Dnase1l3
?/? MEFs和BMDMs及回补实验，发现DNASE1L3缺陷降低TBK1和IRF3磷酸化及IFNB、TNFA、IL6表达，促进HSV-1复制；KO细胞对HSV-1或DNA90诱导的Ifnb、Ifna4、Il6表达降低，回补DNASE1L3可恢复Ifnb表达。
3.3 DNASE1L3 enhances antiviral innate immune responses in vivo：通过Wt与KO小鼠静脉感染HSV-1、qRT-PCR、ELISA和生存曲线，发现KO小鼠脾重/体重比升高，肺和肝中Ifnb、Ifna4、Il6降低，肺和脑中ICP0升高，血清IFN-β和IL-6降低；KO小鼠死亡早发（第5天 vs. 第9天）且生存率降低。
3.4 The nuclease activity is required for DNASE1L3 to enhance HSV-1-induced innate immune response：通过病毒颗粒降解与噬斑实验、H155Q和R206C核酸酶活性缺陷突变体、PV6R抑制及报告基因/Western blotting，发现DNASE1L3不直接损害HSV-1形成噬斑或降解病毒基因组；核酸酶活性缺陷降低其增强IFNB启动子活性和IRF3磷酸化的能力，PV6R抑制核酸酶活性并损害DNASE1L3促进IFNB表达和IRF3磷酸化的作用。
3.5 DNASE1L3 interacts with STING and enhances its activation：通过Co-IP、免疫荧光、结构域映射、SDD-AGE和Western blotting，发现DNASE1L3在检测的信号分子中与STING互作最强，内源互作和共定位得到验证，C端结构域介导该互作；DNASE1L3增强STING寡聚化、S366磷酸化及TBK1募集和共定位，并与STING/TBK1形成前馈环。
3.6 DNASE1L3 enhances TBK1-induced STING oligomerization independent of the nuclease activity：通过突变体、PV6R、Co-IP、SDD-AGE、报告基因和cGAMP刺激，发现H155Q和R206C仍与STING互作，PV6R不破坏该互作；突变体仍促进TBK1诱导的STING寡聚化和IFNB启动子活性，PV6R亦不逆转；cGAMP刺激下DNASE1L3增强IFNB表达，PV6R仅轻度抑制而不消除，说明STING增强分支不依赖核酸酶活性；结合3.4提示DNASE1L3还作用于TBK1上游。
3.7 DNASE1L3 enhances HSV-1-induced cGAS oligomerization dependent on the nuclease activity：通过质谱检测cGAMP、Co-IP和SDD-AGE，发现DNASE1L3过表达增加、敲低降低HSV-1诱导的cGAMP产生，PV6R可逆转该增强；野生型而非H155Q/R206C促进cGAS聚集，PV6R减轻cGAS聚集；DNASE1L3过表达促进HSV-1诱导的cGAS寡聚化，缺陷导致相反表型，且依赖核酸酶活性。
3.8 DNASE1L3 facilitates the release of cGAS, HMGB1, and H1.2 from chromatin：通过核/胞质DNase活性检测、亚细胞分级和Western blotting，发现HSV-1感染下DNASE1L3增加核内而非胞质核酸酶活性；DNASE1L3促进cGAS、HMGB1和H1.2从染色质释放至核可溶组分，该作用在H155Q/R206C突变体和PV6R处理下减弱。
讨论总结：研究人员认为，核内活化的DNASE1L3可重塑染色质，释放被染色质隔离的cGAS、HMGB1和组蛋白H1.2，增强cGAS依赖的DNA感知；胞质中DNASE1L3与STING互作，促进TBK1募集和STING寡聚化，构成不依赖核酸酶的调控分支。核酸酶依赖的核内功能在真实HSV-1感染中占主导，而不依赖核酸酶的STING增强作用位于cGAS-STING启动的下游。DNASE1L3不直接降解胞外HSV-1病毒颗粒；caspase抑制剂Z-VAD-FMK未消除其增强的天然免疫应答，ADP-核糖基化变化是否参与尚待探索。病毒DNA可能被切割为适宜长度以增强cGAS激活，但过度降解也可能抑制病毒感染，净效应取决于平衡。STING增强依赖预先部分激活，S366A突变体与DNASE1L3互作减弱，TBK1过表达可绕过上游并增强结合；PV6R几乎消除DNASE1L3抗病毒作用，与抑制上游cGAS活化有关。HMGB1释放可改变病毒DNA构象并促进cGAS激活；DNASE1L3促进H1.2释放，可能影响染色质可及性。初步实验显示过表达细胞来源核小体DNA更易被自身DNASE1L3或MNase降解，但染色质释放证据仍为相关性。局限包括：多WB条带可能源于细胞类型特异性的蛋白酶切割和翻译后修饰，需质谱蛋白质组学和系统突变确定；HSV-1上调DNASE1L3的机制未明；SDD-AGE产生弥散高分子量信号是该非变性电泳系统的固有技术特征，仍需进一步定量方法。
研究结论（翻译）：总之，DNASE1L3空间定位的差异似乎决定其在DNA病毒感染和自身免疫病中调节天然免疫信号的不同功能。细胞内DNASE1L3通过多种方式增强cGAS-STING通路以促进天然免疫应答。HSV-1感染时，DNASE1L3在核内促进cGAS和HMGB1从染色质释放，增强cGAS活化和cGAMP产生；在胞质中促进STING寡聚化。相反，DNASE1L3通过降解胞外自身DNA拮抗自身免疫病。本研究可能有助于理解人体如何协调对自身DNA和病毒DNA的天然免疫应答。
