RvD1通过FPR2–ARRB2信号与染色质–microRNA调控抑制牛乳腺上皮细胞炎症激活的机制研究

《Frontiers in Immunology》：Resolvin D1 engages FPR2–ARRB2 signaling and chromatin–microRNA regulation to restrain inflammatory activation in bovine mammary epithelial cells

　　

摘要 引言： 乳腺上皮细胞是局部固有免疫的积极参与者，可对炎症刺激产生NF-κB依赖性细胞因子反应。然而，该通路的过度或持续激活可维持炎症状态。消退素D1（Resolvin D1，RvD1）是一种具有促消退活性的脂质介质，但RvD1调控牛乳腺上皮细胞炎症的具体机制尚待阐明。 方法： 研究人员利用MAC-T牛乳腺上皮细胞中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症模型，并在原代牛乳腺上皮细胞中于预设时间点验证选定反应，探讨了RvD1预处理如何减弱后续LPS诱导的炎症激活。 结果： 结果表明，RvD1显著抑制LPS诱导的乳腺上皮炎症，其早期抗炎作用涉及FPR2/ARRB2相关的NF-κB信号抑制。进一步研究发现，ARRB2参与了RvD1介导的MEG3启动子近端区域p65和HDAC1富集的减少以及该区域H3K27ac的恢复。同时，RvD1以FPR2敏感的方式增加CREB磷酸化，并增加CREB在该区域的富集；CREB1敲低减弱了RvD1相关的MEG3和DLK1–DIO3基因座相关miRNA的增加。在这些miRNA中，bta-miR-380-5p和bta-miR-654分别靶向TAB2和IL-33，并有助于RvD1对IL-6和IL-8分泌的后期抑制。 讨论： 这些发现确定了RvD1在牛乳腺上皮细胞中抗炎反应所涉及的受体近端、染色质和microRNA相关机制。

一、研究背景与科学问题

乳腺炎是奶牛中最常见且经济损失最大的疾病之一。乳腺上皮细胞不仅构成局部乳腺屏障，还积极参与局部固有免疫反应。在牛乳腺炎期间，乳腺上皮细胞中炎症信号的激活促进细胞因子和趋化因子的产生，加剧局部炎症的放大，而过量或持续的炎症反应可加重乳腺组织损伤并损害泌乳功能。然而，抗菌药物耐药性和牛奶中抗生素残留的担忧使乳腺炎控制复杂化并引发食品安全问题。因此，除了控制病原体感染外，限制局部乳腺炎症的持续放大并促进炎症消退对于恢复牛乳腺炎期间的乳腺免疫稳态至关重要。

炎症消退并非炎症信号的被动衰减，而是由内源性介质主动调控的生物学过程。消退素D1（RvD1）是一种代表性的二十二碳六烯酸来源的特异性促消退介质，可通过包括脂氧素A4受体/甲酰肽受体2（ALX/FPR2）和G蛋白偶联受体32（GPR32）在内的受体限制过度炎症并促进炎症消退。FPR2作为G蛋白偶联受体，其内化和运输涉及β-arrestin，且β-arrestin 2（ARRB2）已被报道可与NF-κB抑制剂α（IκBα）相互作用并限制NF-κB激活。然而，RvD1是否通过FPR2下游的ARRB2在牛乳腺上皮细胞中抑制NF-κB信号尚未明确。

炎症反应不仅受受体近端信号和转录控制调控，还受影响炎症mRNA稳定性和翻译的转录后机制调控。microRNA（miRNA）是长度约18–25 nt的小型非编码RNA，可通过结合靶mRNA的3′非翻译区（UTR）抑制翻译或促进mRNA降解，从而调控多个炎症相关基因。RvD1可通过改变miRNA表达参与这一调控层面。DLK1–DIO3印记区域包含母源表达3（MEG3）长链非编码RNA（lncRNA）、小核仁RNA和一组miRNA簇。该区域miRNA参与发育、代谢和细胞命运调控，其表达改变也见于免疫介导和炎症性疾病中。然而，这些调控层面是否与牛乳腺上皮细胞中后续的染色质调控和DLK1–DIO3相关miRNA表达相关联仍不清楚。

基于LPS是已充分表征的TLR4激动剂，可激活牛乳腺上皮细胞中NF-κB信号和炎症细胞因子反应，研究人员采用LPS诱导的炎症模型结合RvD1预处理，检验RvD1是否通过FPR2–ARRB2信号减弱后续炎症激活，以及这一早期信号如何与后续染色质调控和DLK1–DIO3 miRNA表达相连接。研究人员假设RvD1预处理通过协调的受体近端、染色质和miRNA介导机制减弱牛乳腺上皮细胞中LPS诱导的炎症反应。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员在MAC-T永生化牛乳腺上皮细胞中建立LPS诱导的炎症模型，并在原代牛乳腺上皮细胞（来源于三头泌乳奶牛屠宰后乳腺组织，经组织外植体长出法建立）中于预设时间点验证关键反应。主要技术方法包括：蛋白质印迹（Western blot）检测信号蛋白磷酸化与总蛋白水平；核质分离检测p65核转位；免疫荧光染色结合TSA技术评估FPR2与ARRB2的共定位；免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白间相互作用及IκBα的K48连接多聚泛素化；CUT&Tag-qPCR检测MEG3启动子近端区域p65、HDAC1、H3K27ac和CREB1的染色质富集；JASPAR和STRING数据库预测转录因子结合位点及蛋白互作；小RNA测序（small RNA sequencing）结合edgeR分析差异表达miRNA；TargetScan和miRanda预测miRNA靶基因并进行GO和KEGG功能富集分析；双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与靶基因3′UTR的直接结合；RT-qPCR检测mRNA、lncRNA和miRNA表达；ELISA检测IL-6和IL-8分泌水平。

三、研究结果

RvD1减弱牛乳腺上皮细胞中LPS诱导的炎症激活。 研究人员首先验证了MAC-T细胞中LPS–TLR4信号系统的响应性，确认TLR4蛋白在基础和LPS刺激条件下均可检测，LPS刺激随时间增加TRAM–TRIF结合和IRF3磷酸化。RvD1预处理显著降低LPS诱导的p-p65和p-IκBα水平，减弱IκBα降解，并降低IL6和IL8 mRNA表达及IL-6和IL-8蛋白分泌，其中NF-κB抑制在1小时最显著，细胞因子分泌抑制在48小时最明显。

FPR2参与RvD1介导的LPS诱导NF-κB激活和细胞因子产生的抑制。 使用FPR2拮抗剂WRW4后，RvD1对p-p65、p-IκBα的降低作用和对IκBα的保护作用被部分逆转，RvD1对IL6和IL8 mRNA表达及蛋白分泌的抑制作用也显著减弱。免疫荧光显示RvD1处理后FPR2和ARRB2荧光信号出现明显重分布且空间重叠增加，而WRW4减弱了这些变化。

ARRB2介导RvD1诱导的NF-κB激活和细胞因子产生的抑制。 通过siRNA敲低ARRB2后，RvD1对p-p65和p-IκBα的抑制作用被逆转，IκBα降解增强，RvD1对IL6和IL8 mRNA表达及蛋白分泌的抑制效果减弱。免疫共沉淀显示RvD1增强FPR2–ARRB2和ARRB2–IκBα的结合，而WRW4减弱这两种结合。LPS增加IκBα的K48连接多聚泛素化，RvD1预处理降低该修饰，ARRB2敲低减弱了RvD1介导的这一降低。

RvD1上调DLK1–DIO3簇miRNA并与炎症负反馈调控相关。 小RNA测序显示，与LPS组相比，RvD1+LPS组有103个差异表达miRNA。DLK1–DIO3印记区域内多个miRNA（包括bta-miR-380-5p、bta-miR-654、bta-miR-381、bta-miR-379等）在LPS单独刺激下未被明显诱导，但在RvD1预处理联合LPS刺激下被协同上调，且表达模式高度相关。GO分析显示其预测靶基因富集于IL-8产生调控、细胞因子产生调控、Toll样受体信号通路、炎症反应等生物学过程。预测的miRNA–靶基因网络将多个DLK1–DIO3 miRNA与TAB2、IL-33、TRAF6、TLR4等炎症相关基因相连。RT-qPCR确认LPS单独降低MEG3表达但未增加选定miRNA，RvD1预处理联合LPS刺激则最一致地增加MEG3和所检miRNA的表达。

bta-miR-380-5p靶向TAB2并参与RvD1对炎症细胞因子的后期抑制。 bta-miR-380-5p模拟物降低LPS诱导的TAB2蛋白表达，其抑制剂部分减弱RvD1处理后TAB2蛋白的降低。双荧光素酶报告实验证实bta-miR-380-5p直接靶向TAB2 3′UTR中的预测结合位点。靶标拯救实验中，携带miRNA结合位点突变的TAB2表达构建体（oeTAB2-MUT）在bta-miR-380-5p模拟物和LPS存在下增加TAB2蛋白丰度及IL-6和IL-8分泌。

bta-miR-654靶向IL-33并参与RvD1对炎症细胞因子的后期抑制。 bta-miR-654模拟物降低LPS诱导的IL-33蛋白丰度，其抑制剂减弱RvD1介导的IL-33降低。双荧光素酶报告实验证实bta-miR-654直接靶向IL-33 3′UTR中的预测结合位点。靶标拯救实验中，oeIL-33-MUT在bta-miR-654模拟物和LPS存在下增加IL-33蛋白丰度及IL-6和IL-8分泌。

ARRB2参与RvD1介导的MEG3启动子近端区域染色质调控。 核质分离显示RvD1预处理减少LPS诱导的核内p65积累，ARRB2敲低减弱该抑制作用。p65敲低部分缓解LPS诱导的MEG3表达降低，但未明显增加bta-miR-380-5p和bta-miR-654。CUT&Tag-qPCR显示LPS增加p65在MEG3启动子p65-P1区域的富集，RvD1预处理降低该富集，ARRB2敲低减弱RvD1的抑制作用。在相同区域，RvD1增加LPS刺激下的H3K27ac富集，ARRB2敲低减弱该恢复效应。LPS增强核内p65–HDAC1相互作用和HDAC1在p65-P1区域的富集，RvD1减弱这些变化，ARRB2敲低削弱RvD1的作用。HDAC1敲低缓解LPS诱导的MEG3表达降低并增加p65-P1区域H3K27ac富集。

RvD1激活CREB并促进MEG3和DLK1–DIO3簇miRNA的表达。 RvD1单独处理随时间增加CREB磷酸化，在LPS存在下进一步增加p-CREB水平，WRW4减弱该效应。CUT&Tag-qPCR显示RvD1显著增加CREB1在CREB1-P1区域的富集，CREB1敲低显著降低RvD1诱导的CREB1富集。CREB1敲低减弱RvD1介导的MEG3、bta-miR-380-5p和bta-miR-654上调，并部分恢复TAB2和IL-33蛋白表达及IL-6/IL-8输出。

RvD1在原代牛乳腺上皮细胞中诱导DLK1–DIO3 miRNA相关反应。 在原代牛乳腺上皮细胞中，RvD1预处理降低LPS诱导的p-p65和p-IκBα水平并减弱IκBα蛋白丰度的降低。LPS降低MEG3表达而未显著改变bta-miR-380-5p或bta-miR-654，RvD1预处理在LPS刺激下增加三者表达。RvD1预处理还降低LPS诱导的TAB2和IL-33蛋白丰度增加及IL-6/IL-8分泌。

四、讨论与结论

讨论部分指出，RvD1预处理反映其减弱后续LPS诱导炎症激活的能力。FPR2的药理学抑制减弱RvD1抑制LPS诱导炎症的能力，表明该效应至少部分依赖FPR2。RvD1增强FPR2–ARRB2和ARRB2–IκBα结合，ARRB2敲低减弱RvD1降低IκBα K48连接多聚泛素化、NF-κB激活及IL-6/IL-8表达和分泌的能力。LPS单独未明显诱导DLK1–DIO3簇miRNA，而RvD1在LPS存在下更显著地增加MEG3和选定miRNA，提示炎症环境可能放大该反应。bta-miR-380-5p靶向TAB2、bta-miR-654靶向IL-33，与早期ARRB2–IκBα数据共同支持一个时间分层模型：RvD1首先抑制NF-κB激活，随后通过bta-miR-380-5p/TAB2和bta-miR-654/IL-33轴限制IL-6/IL-8分泌。RvD1降低LPS诱导的核内p65积累和p65在MEG3启动子p65-P1区域的占据，ARRB2参与该过程。LPS增加p65–HDAC1相互作用和HDAC1占据，RvD1减弱这些变化。HDAC1敲低恢复H3K27ac并缓解MEG3表达降低。p65敲低仅部分缓解MEG3降低而未诱导miRNA，提示释放p65相关抑制不足以解释RvD1对DLK1–DIO3簇miRNA的诱导。RvD1增加CREB磷酸化，WRW4减弱该效应，CREB1在MEG3调控区域的占据增加与MEG3表达相关，CREB1敲低减弱RvD1诱导的MEG3和miRNA增加，表明CREB激活不仅是炎症改变的标志。

结论部分总结：RvD1–FPR2信号促进ARRB2–IκBα相互作用，减少IκBα的K48连接多聚泛素化，限制早期NF-κB激活。ARRB2还参与RvD1对MEG3启动子近端区域p65/HDAC1占据和H3K27ac的调控。与此同时，FPR2敏感的CREB磷酸化及CREB1在该区域占据的增加有助于RvD1诱导MEG3和DLK1–DIO3簇miRNA。bta-miR-380-5p和bta-miR-654分别靶向TAB2和IL-33，参与IL-6和IL-8分泌的抑制。原代牛乳腺上皮细胞中观察到的RvD1抗炎反应进一步支持了MAC-T细胞中表征反应的生物学相关性。这些发现阐明了受体近端信号、染色质调控和miRNA介导的转录后控制汇聚于限制牛乳腺上皮细胞炎症输出的机制。