基于CRISPR的剪接因子突变癌症中致癌性AS-NMD的修复策略研究

《Frontiers in Immunology》：CRISPR-mediated correction of oncogenic AS-NMD in splicing factor mutant cancer

与无义介导的mRNA衰变偶联的选择性剪接（AS-NMD）已进化为基因表达的主要调控机制。AS-NMD的失调已被确定为许多人类疾病的根源，从发育缺陷到致命癌症。毒外显子（PE）是高度保守的选择性外显子，包含提前终止密码子，当被纳入转录本时引发AS-NMD。癌细胞常利用PE的纳入来下调肿瘤抑制因子，或利用PE的排除来上调致癌蛋白。因此，PE作为癌症及其他疾病的新型治疗途径已引起广泛关注。此前已有报道称，剪接因子SRSF2中的致癌突变通过纳入PE促进肿瘤抑制因子EZH2的下调，导致染色质调控改变、造血功能缺陷及癌症发生。在此，研究人员检验了一种基于CRISPR的策略来操控PE介导的致癌性AS-NMD的治疗概念验证。利用配对向导RNA（pgRNA），研究人员成功地从SRSF2突变型白血病基因组中删除了EZH2的PE。该编辑使EZH2 mRNA不再含有PE，并恢复了EZH2蛋白表达。这随后恢复了多梳抑制复合物2（PRC2）的关联以及全局H3K27组蛋白甲基化。所提出的CRISPR策略为纠正致癌性PE纳入提供了令人信服的证据，凸显了其针对癌症及其他人类疾病中PE的治疗应用潜力。

一、研究背景与问题

人类基因组通过精确的基因表达调控维持生物学功能。选择性剪接（AS）与无义介导的mRNA衰变（NMD）作为两种转录后RNA加工机制，在基因表达调控中发挥关键作用。约95%的人类多外显子基因经历AS，约33%的选择性剪接转录本是NMD的靶标。AS-NMD将这两种机制偶联，成为基因表达的重要调控层级。当AS-NMD失调时，可导致发育缺陷、神经系统疾病、代谢紊乱、免疫功能障碍乃至癌症等多种人类疾病。

毒外显子（PE）是一类高度保守的盒式外显子，含有提前终止密码子（PTC），当其被纳入转录本时触发AS-NMD。癌细胞常利用PE的纳入下调肿瘤抑制因子，或通过排除PE上调致癌蛋白。在剪接因子突变驱动的血液恶性肿瘤中，SRSF2突变（SRSF2^Mut）可促进肿瘤抑制基因EZH2中PE的异常纳入，引发AS-NMD，导致EZH2蛋白水平下调、染色质调控异常、造血功能缺陷及癌症发展。

目前针对PE介导的AS-NMD的治疗策略存在诸多局限：反义寡核苷酸（ASO）面临递送困难、剂量优化、稳定性及通量问题；RNA干扰无法实现基因特异性的剪接改变；小分子化合物常因脱靶效应表现出毒性并在临床试验中失败。因此，亟需开发新型、有效的基因特异性靶向治疗策略。

二、研究内容与结论

研究人员提出了一种基于CRISPR/Cas9的基因特异性靶向策略，旨在通过基因组水平删除致癌性PE，纠正异常剪接并恢复靶基因表达。作为概念验证，研究人员以携带SRSF2致癌突变（SRSF2^P95H/WT）的血液癌细胞系K052及基因敲入突变细胞系K562^Mut为模型，靶向EZH2基因中的PE。

研究结果表明，通过配对向导RNA（pgRNA）介导的基因组编辑成功删除了EZH2的PE，使EZH2 mRNA不再含有PE，从而逃避AS-NMD降解，恢复EZH2蛋白表达。这一恢复进一步重建了PRC2复合物的组装，并恢复了全局H3K27组蛋白甲基化水平。此外，PE删除部分调节了细胞周期动力学和细胞凋亡，并在与ASO策略的对比中显示出更稳定持久的剪接调控效果。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术：配对向导RNA（pgRNA）设计策略，靶向EZH2 PE侧翼内含子序列，克隆至Lenti-multi-CRISPR载体（含Cas9和嘌呤霉素抗性基因），通过慢病毒转导递送至SRSF2突变癌细胞系（患者来源的K052细胞系和基因敲入K562^Mut细胞系）；逆转录PCR（RT-PCR）分析剪接模式；蛋白质印迹（Western blotting）检测蛋白表达；免疫共沉淀（Co-IP）分析PRC2复合物组装；流式细胞术分析细胞周期和凋亡；实时细胞生长分析系统监测细胞增殖。

四、研究结果

1. AS-NMD是剪接因子突变癌症肿瘤发生的关键介质

通过对TCGA-LAML数据库中SRSF2^Mut与SRSF2^WT AML患者的RNA测序数据重新分析，研究人员鉴定出843个差异剪接事件（DSE），其中约16%为AS-NMD靶标。实验验证确定了几个癌症驱动事件，包括EZH2中毒外显子纳入介导的AS-NMD、INTS3中内含子保留介导的AS-NMD以及CLK3中选择性外显子排除介导的AS-NMD。

2. SRSF2^Mut癌症模型中EZH2 PE异常纳入的再现

在多种白血病细胞系中，K052（天然携带SRSF2^P95H/WT）和K562^Mut（基因敲入SRSF2^P95H/WT）表现出EZH2 PE的排他性纳入及EZH2蛋白表达下调，而SRSF2^WT细胞系则无此现象，证实了SRSF2^Mut促进PE介导的EZH2 AS-NMD。

3. pgRNA介导的CRISPR策略可行性验证

利用靶向HPRT1外显子2的pgRNA（pgHPRT1-S1和pgHPRT1-S2），研究人员在K052细胞中成功实现了外显子删除，导致HPRT1 mRNA中外显子2跳跃、蛋白失活及6-硫鸟嘌呤（6-TG）抗性，验证了pgRNA介导的选择性外显子删除策略在SRSF2^Mut血癌细胞中的可靠性。

4. pgRNA介导的EZH2 PE基因组删除

设计三组pgRNA（pgEZH2-S1、S2、S3）靶向EZH2 PE侧翼内含子序列，在K052和K562^Mut细胞中成功实现了PE的基因组删除。基因组PCR和Sanger测序确认了大多数克隆的完全基因组切除。

5. EZH2 PE删除纠正异常剪接并恢复蛋白表达

RT-PCR和Western blotting分析显示，pgRNA编辑的K052和K562^Mut细胞中EZH2 PE纳入显著降低，EZH2蛋白表达显著恢复，证实PE删除产生了不被AS-NMD降解的规范EZH2 mRNA转录本异构体。

6. 靶向剪接调控的特异性评估

对11个SRSF2^Mut诱导的差异剪接靶标（包括EZH2、ARMC10、ATF2、CDC45、CDK5RAP2、DGUOK、CRAT、WDR45、MELK、PFKM和SLC25A26）进行RT-PCR分析，发现pgEZH2处理仅调节EZH2 PE的剪接，不影响其他基因，表明该策略具有可靠的靶向特异性。

7. EZH2 PE删除恢复全局H3K27组蛋白甲基化

Western blotting分析显示，pgEZH2编辑的K052细胞中H3K27me3水平显著升高，而总组蛋白H3水平不变。EZH2抑制剂（EPZ-6438）处理可逆转这一效应，证实H3K27me3的恢复由EZH2介导。Co-IP实验表明，PE删除恢复了PRC2复合物中EZH2亚基的关联，而EED、SUZ12和RBAP48等非酶亚基水平不变。

8. EZH2 PE删除部分调节细胞周期动力学和细胞凋亡

实时细胞生长分析显示，pgEZH2编辑的K052细胞增殖增强。流式细胞术分析表明，PE删除导致G1和G2期细胞比例轻微减少，早期凋亡效率降低。

9. CRISPR策略与反义技术的比较研究

与ASO2（靶向EZH2 PE外显子剪接增强子元件的反义寡核苷酸）相比，pgEZH2-S1编辑实现了完全的PE跳跃，而ASO2仅促进部分跳跃。10天时间过程分析显示，ASO2的剪接调控效果随时间逐渐减弱，而CRISPR编辑的效果稳定持久。

五、讨论与结论

本研究的创新之处在于利用CRISPR/Cas9技术反向恢复基因表达，而非传统的基因敲除。pgRNA靶向选择性外显子侧翼内含子序列，即使编辑过程中产生插入或缺失，也会在内含子剪接时被排除，不破坏mRNA阅读框。该策略目前仅适用于选择性盒式外显子，对于其他类型的AS-NMD事件（如外显子跳跃、内含子保留效率低下或选择性剪接位点选择）需开发替代策略。由于SRSF2突变癌症中多个基因（EZH2、INTS3、CLK3等）的异常剪接共同驱动肿瘤发生，单一基因的修复仅提供部分表型拯救，未来研究将致力于开发单载体同时纠正多个基因AS-NMD的组合策略，并在临床前动物模型中验证。

研究结论：研究结果提供了令人信服的证据，证明配对向导RNA介导的CRISPR/Cas9策略可以从癌细胞基因组中删除盒式外显子。该策略能有效去除致癌性毒外显子，恢复靶基因蛋白表达，并拯救失调的PRC2关联和全局H3K27组蛋白甲基化。因此，该研究凸显了配对向导RNA介导的CRISPR/Cas9策略在操控与癌症及许多其他人类疾病相关的异常AS-NMD方面的潜力。