《Frontiers in Immunology》：Persistent nodal disease with squamous differentiation and spatial immune heterogeneity after chemoimmunotherapy in biliary tract cancer: a high-resolution pathological analysis
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背景： 胆道癌（BTC）系统性治疗后可能出现不同病灶间的异质性反应，但其病理学和免疫学特征仍不明确。研究人员报告一例病例，该患者在序贯化疗和免疫治疗后，原发灶和肺转移灶达到病理完全缓解（pCR），但淋巴结病变持续存在。
病例展示： 一名50多岁的男性转移性肝门
背景： 胆道癌（BTC）系统性治疗后可能出现不同病灶间的异质性反应，但其病理学和免疫学特征仍不明确。研究人员报告一例病例，该患者在序贯化疗和免疫治疗后，原发灶和肺转移灶达到病理完全缓解（pCR），但淋巴结病变持续存在。
病例展示： 一名50多岁的男性转移性肝门部胆管癌患者接受了吉西他滨联合顺铂治疗。因过敏反应停用顺铂（无影像学进展），随后接受吉西他滨联合度伐利尤单抗、吉西他滨单药及度伐利尤单抗维持治疗。手术切除显示原发胆道病灶和肺转移灶呈pCR，而22枚区域淋巴结中有3枚仍存在活跃的癌细胞。所有三枚转移性淋巴结均显示出明显的角化性鳞状分化，伴有p40表达和CK7表达缺失。对其中一枚淋巴结的空间分析显示，无论从阳性细胞比例还是细胞密度来看，肿瘤边缘的CD8阳性细胞丰度均高于肿瘤核心。FoxP3阳性细胞也呈现边缘优势分布，而LAG-3表达和PD-L1 H评分在核心区更高，TIM-3则广泛分布。另一枚淋巴结表现出不同的CD8分布模式，表明存在淋巴结间异质性。
结论： 本病例显示了BTC化疗免疫治疗后部位特异性的病理异质性，即尽管原发灶和肺转移灶达到pCR，但淋巴结病变持续存在。残留的淋巴结转移灶显示出角化性鳞状分化以及免疫细胞分布的淋巴结间异质性。由于缺乏配对的治疗前淋巴结组织、分子或克隆性分析、细胞类型特异性检查点评估以及空间免疫谱分析，其生物学基础及普适性仍未明确。
胆管癌化疗免疫治疗后淋巴结持续性病变与空间免疫异质性的病理学解析
一、研究背景与研究目的
胆道癌（biliary tract cancer, BTC）是一种侵袭性强、预后较差的恶性肿瘤。近年来，化疗联合免疫检查点抑制剂（chemoimmunotherapy）在晚期BTC中展现出显著的抗肿瘤活性。然而，临床观察发现，即使在同一患者体内，不同部位的肿瘤病灶对同一系统性治疗方案的反应可能存在显著差异，这种现象被称为异质性反应（heterogeneous response）。例如，原发灶和某些远处转移灶可能达到病理完全缓解（pathological complete response, pCR），而其他部位的病灶却持续存在甚至进展。这种位点特异性的治疗抵抗机制尚不完全清楚，尤其是在BTC中，关于化疗联合免疫治疗后不同病灶间病理和免疫微环境差异的研究十分有限。
区域淋巴结不仅是BTC常见的转移部位，同时也是高度组织化的免疫微环境。淋巴结内的肿瘤-宿主相互作用可能与原发灶或远处转移灶截然不同。因此，当其他病灶获得良好疗效时，淋巴结内肿瘤的持续存在为研究位点特异性治疗反应的病理和空间免疫特征提供了独特的契机。本研究旨在通过一例详尽的病例分析，揭示BTC在化疗免疫治疗后出现不一致病理反应（discordant pathological response）的高分辨率病理学特征，重点关注持续性淋巴结转移灶的形态学改变及其空间免疫微环境特点。
二、研究方法
本研究为单病例分析。研究对象为一名50多岁、患有转移性肝门部胆管癌的男性患者。该患者接受了包括吉西他滨+顺铂、吉西他滨+度伐利尤单抗、吉西他滨单药以及度伐利尤单抗维持治疗的序贯系统性治疗。研究人员分析了患者在接受根治性手术后的手术标本，包括经胸腔镜肺楔形切除术（video-assisted thoracic surgery, VATS）获取的肺转移灶、经保留幽门的胰十二指肠切除术（pylorus-preserving pancreatoduodenectomy, PPPD）获取的原发性胆道病灶及22枚区域淋巴结。
主要技术方法包括：
- 1.
常规组织病理学与免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）： 对福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）的组织切片进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色和IHC染色。用于谱系鉴定的抗体包括p40（ΔNp63）和细胞角蛋白7（cytokeratin 7, CK7）；用于免疫微环境分析的抗体包括CD8、FoxP3、PD-L1、LAG-3和TIM-3。此外，对一枚淋巴结额外进行了癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）和CD68染色。
- 2.
全玻片成像与数字空间免疫分析： 利用高分辨率全玻片扫描仪数字化组织切片，并使用QuPath软件（版本0.6.0）进行定量图像分析。研究人员手动勾画了肿瘤区域，并由认证病理医师复核。为进行空间免疫分析，将肿瘤区域分为两个预设区室：肿瘤边缘（定义为距离肿瘤-间质界面50微米以内的区域）和肿瘤核心（定义为内部存活的肿瘤巢，包括角化鳞状区域）。研究人员在选定的一枚转移性淋巴结内，对CD8、FoxP3、LAG-3、TIM-3和PD-L1的表达进行了详细的定量空间分析。CD8阳性细胞的量化指标包括阳性细胞比例和阳性细胞密度（cells/mm2），PD-L1采用H评分（范围0-300）进行评估。统计比较采用Wilcoxon秩和检验。
三、研究结果
3.1 序贯系统性治疗后不同病灶间的不一致病理反应
研究发现，该患者在接受序贯治疗后，原发胆道病灶和肺转移灶均达到了病理完全缓解（pCR，Evans IV级），表现为致密的纤维化和泡沫细胞浸润，未见存活肿瘤细胞。然而，在切除的22枚区域淋巴结中，有3枚仍存在活跃的癌组织。这揭示了化疗免疫治疗后BTC中存在一种不一致的病理反应模式，即原发性及肺转移灶被清除，而区域淋巴结疾病持续存在。
3.2 残留淋巴结转移灶表现出异质性形态和鳞状分化
所有3枚残留的转移性淋巴结均呈现出显著的角化性鳞状分化（keratinizing squamous differentiation），表现为p40（鳞状细胞标志物）弥漫性阳性表达，同时失去了腺上皮标志物CK7的表达。这一表型与原始胆管腺癌的表型截然不同。此外，其中一枚淋巴结还出现了富含组织细胞/巨噬细胞的区域，并观察到CEA阳性和CD68阳性染色的部分空间重叠，提示了淋巴结间的组织病理学异质性。
3.3 空间免疫图谱显示CD8和FoxP3的差异化分布
研究人员对一枚呈现角化性鳞状分化的转移性淋巴结进行了详细的空间免疫分析。结果显示：
- •
CD8阳性T细胞： 无论是在阳性细胞比例（52.7% vs. 23.3%，P=0.008）还是阳性细胞密度（7753.5 ± 2460.4 vs. 1925.3 ± 833.0 cells/mm2，P=0.008）方面，肿瘤边缘的CD8阳性细胞均显著高于肿瘤核心，呈现出边缘优势分布。
- •
FoxP3阳性调节性T细胞： 同样呈现出边缘优势分布，其在肿瘤边缘的阳性细胞比例（10.8%）高于肿瘤核心（6.4%，P=0.032）。
- •
淋巴结间异质性： 对另一枚转移性淋巴结的额外评估显示，CD8阳性细胞的分布模式不同。它们相对丰富地存在于滤泡和滤泡周围淋巴样区室中，但在与肿瘤相关的区域内数量稀少，表明存在淋巴结间的免疫微环境异质性。
3.4 检查点标志物在肿瘤边缘和核心的表达差异
在同一枚进行定量分析的淋巴结中：
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TIM-3： 在肿瘤边缘和核心均有高表达，未表现出显著的空间差异。
- •
LAG-3： 在肿瘤核心的表达水平（37.9%）显著高于肿瘤边缘（22.0%，P=0.016）。
- •
PD-L1： 其H评分在肿瘤核心（128.6）显著高于肿瘤边缘（44.7，P=0.032）。
这些结果表明，在该淋巴结病灶内，免疫检查点标志物的表达存在空间异质性。
四、总结与讨论
本研究通过一例详尽的病例分析，揭示了BTC在化疗免疫治疗后一种独特的位点特异性病理反应模式：尽管原发灶和肺转移灶实现了pCR，但区域淋巴结内仍有肿瘤持续存在，且这些残留的转移灶普遍表现出角化性鳞状分化。这表明治疗效果在不同病灶间存在差异。
在讨论部分，研究人员指出，虽然无法从单病例确定持续性淋巴结疾病的机制，但鳞状分化的出现是一个显著特征。由于缺乏配对的治疗前淋巴结组织和分子/克隆性分析，无法区分该表型是治疗诱导的谱系可塑性（lineage plasticity）结果，还是预先存在的肿瘤亚群被选择的结果。此外，在定量分析的淋巴结中观察到的空间免疫异质性（如CD8细胞边缘富集、PD-L1/LAG-3核心富集）描述了病灶内的免疫格局，但不能推广至所有淋巴结，因为另一枚淋巴结显示了不同的CD8分布模式。
研究结论： 本病例展示了BTC化疗免疫治疗后，尽管原发灶和肺转移灶达到pCR，但淋巴结疾病持续存在，并伴有角化性鳞状分化和淋巴结间免疫细胞分布的异质性。由于缺乏配对的治疗前淋巴结组织、分子或克隆性分析、细胞类型特异性检查点评估及全面的空间免疫谱分析，这些观察结果的生物学基础和普适性仍需进一步研究。
