外周血多形核白细胞中瓜氨酸化组蛋白H3及多胺代谢基因表达升高作为癌症患者免疫治疗不良应答的生物标志物

《Molecular Biomedicine》：Citrullinated histone H3 and elevated polyamine metabolism gene expression in peripheral blood polymorphonuclear leukocytes as biomarkers for poor immunotherapy response in cancer patients

目前迫切需要识别经验证的可预测癌症患者结局的生物标志物。本研究评估了外周血中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及多胺基因表达的生物标志物，这些标志物可能与免疫治疗不良应答风险较高相关。研究人员分析了接受化疗/免疫治疗（chemo/immunotherapy）的癌症患者及健康志愿者的外周血中瓜氨酸化组蛋白H3（Cit H3，一种NETosis标志物）、炎症细胞因子及循环组织因子阳性微粒（TF⁺MPs）水平。血浆TF⁺MPs、Cit H3、白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-6（IL-6）水平升高均与免疫治疗不良应答显著相关。由于体外刺激人和小鼠中性粒细胞形成NETs可被多胺摄取抑制剂（Trimer44NMe）阻断，研究人员进一步评估了外周血单个核细胞（PBMCs）和多形核白细胞（PMN）中多胺/谷氨酰胺代谢基因的核糖核酸（RNA）表达。PBMCs中谷氨酰胺相关基因表达升高及PMN中多胺相关基因表达降低与患者对免疫治疗的良好应答相关。尽管未达到显著水平，外周PMN中较高的总体多胺评分以及血浆Cit H3水平升高与癌症患者免疫治疗不良应答密切相关。在三阴性乳腺癌（TNBC）小鼠模型中，多胺阻断治疗不仅抑制原发肿瘤生长和肺转移，还减少瘤内NETs。研究结果提示PMN中NETosis与多胺基因表达之间存在机制联系，值得进一步研究作为免疫治疗应答的外周血生物标志物。

研究背景与问题：免疫检查点抑制剂（ICI）虽可使部分癌症患者获得持久缓解，但许多患者仍不能获益，且可能发生严重免疫毒性，因此迫切需要可预测ICI应答、辅助选择抗癌药物的新生物标志物。中性粒细胞募集和活化与肿瘤治疗抵抗及转移相关；NETs在肿瘤组织中常较丰富并与肿瘤进展、转移相关，NETosis亦被认为参与癌症相关血栓形成并驱动肿瘤进展，NETs与肿瘤细胞相互作用可诱导化疗/免疫治疗抵抗，外周血NETosis标志物与化疗抵抗和生存不良相关。多胺（腐胺、亚精胺、精胺）可稳定NETs，并可激活肽酰精氨酸脱亚氨酶4（PAD4）导致组蛋白瓜氨酸化、触发NETosis；多胺在多数肿瘤中显著升高，且可调节染色质重塑、离子通道、细胞增殖存活和免疫细胞功能，促进免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。肿瘤组织高多胺代谢基因表达评分和/或多胺水平与多种癌症免疫治疗不良应答相关，但仍需在易获得的血液样本中识别可区分免疫治疗应答者的标志物。
研究开展与意义：研究人员分析癌症患者及健康志愿者血浆、PBMCs和PMN中NETosis标志物、细胞因子水平及多胺代谢基因表达，探索其与免疫治疗应答的关系；该研究发表于《Molecular Biomedicine》。研究提示血浆NETosis标志物及循环PMN中多胺相关基因表达可能作为癌症患者免疫治疗应答的预后指标，并提出NETosis与PMN多胺基因表达之间的机制联系，值得进一步验证。
关键技术与样本来源：研究纳入接受化疗/免疫治疗的癌症患者（含肺癌、TNBC、肾癌、黑色素瘤、间皮瘤和胆管癌）及健康志愿者，经Lankenau Institutional Review Board批准；基因表达分析使用同一患者库和健康志愿者的135份血样。技术包括制备血小板贫血浆（PPP）、流式检测TF⁺MPs、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测Cit H3、细胞因子微珠阵列联合流式检测IL-6/IL-8；PolymorphPrep分离PBMCs和PMN，定量聚合酶链反应（qPCR）检测多胺/谷氨酰胺代谢基因；LASSO logistic回归构建加权基因评分；体外人和小鼠中性粒细胞NET形成实验；4T1 TNBC原位小鼠模型给予PBT±Dox，评估肿瘤生长、肺转移和瘤内NETs。
研究结果：（1）Increased levels of NETosis-related factors and cytokines in cancer patients：对癌症患者和健康志愿者PPP分析显示，健康志愿者循环TF⁺MPs较低（150 μl PPP中<1,200）且血浆Cit H3较低（<0.6 ng/mL）；癌症患者中TF⁺MPs≥1,200与高Cit H3显著相关，TF⁺MPs与IL-6、IL-8和TNF-α强相关；血浆Cit H3、TF⁺MPs、IL-8和IL-6各自与免疫治疗不良应答显著相关。结论提示这些NETosis相关因子和细胞因子是免疫治疗不良应答的标志物。（2）Association between NET formation and polyamine accumulation：人中性粒细胞经血小板活化因子（PAF）刺激形成NETs，癌症患者PPP而非健康PPP可增强亚阈值PAF诱导的NETosis；Trimer44NMe多胺转运抑制剂（PTI）完全抑制人和小鼠中性粒细胞NETosis，而DFMO不阻断；TPA刺激30 min后细胞表面ATP13A3和Cit H3增加，早于DNA-组蛋白NETs挤出。结论提示NET形成与多胺转运进入中性粒细胞存在早期机制联系，ATP13A3为潜在靶点。（3）Polyamine blocking therapy alleviates doxorubicin-promoted metastasis and decreases 4T1 tumor NETs：在4T1原位TNBC小鼠中，低剂量多柔比星（Dox）不抑制原发瘤，而多胺阻断治疗（PBT）或Dox+PBT显著抑制肿瘤生长；Dox单药增加肺转移，PBT共处理抑制Dox诱导的肺转移；PBT和PBT+Dox较载体对照抑制瘤内Ly6G⁺Cit H3⁺中性粒细胞。结论提示多胺至少部分参与肿瘤NETosis及由此导致的转移。（4）Polyamine metabolic gene expression as biomarkers for predicted treatment response：对135份血样PBMCs和PMN行qPCR显示，癌症患者PBMCs和PMN中ARG1、ODC、ATP13A3和SMOX升高，ODC升高与MYC升高相关，PBMCs中谷氨酰胺代谢增加；个体基因与治疗应答的强关联证据有限。通路评分中，PBMCs谷氨酰胺代谢评分在应答者较高（名义p=0.037，校正后不显著），PMN多胺评分在应答者数值较低但无统计学意义；LASSO在PBMC中选择NOS2、ODC、PAOX、ALDH18A1、OAT、MMP9，在PMN中选择ODC、SMOX、PAOX、OAT，加权基因评分与治疗应答显著相关（PBMC OR 2.6，95% CI 0.87–4.3，p=0.003；PMN OR 3.3，95% CI 0.5–6.2，p=0.022），AUC分别约89.6%和86.1%，交叉验证AUC约85.5%和82.5%。结论提示LASSO加权基因评分具有较好区分能力，可作为待验证的候选特征。（5）High overall PMN polyamine expression score and increased plasma Cit H3 levels correlate with poor response to immunotherapy：分析PMN多胺评分与Cit H3的交互显示，应答者中二者呈中等正相关，非应答者关联较弱且变异较大；低PMN多胺评分时Cit H3与良好应答概率较高，较高PMN多胺评分时Cit H3升高与应答概率下降相关；交互作用p=0.071未达常规显著；PBMC多胺基因与Cit H3无显著相关，细胞因子和TF⁺MPs未显示与PMN多胺基因的应答依赖性关联。结论提示尽管未达显著水平，高总体PMN多胺评分及血浆Cit H3升高与免疫治疗不良应答相关。
讨论部分总结：肿瘤组织高多胺及多胺代谢基因表达与多种癌症不良预后和免疫治疗不良应答相关，血液或尿液多胺代谢物也被提出作为卵巢癌、乳腺癌和结肠癌早期肿瘤标志物；本研究首次探索循环白细胞多胺代谢基因表达与癌症免疫治疗应答的相关性。外周血标志物具有样本易获得、可在治疗过程中多次检测等优点。多胺可支持免疫抑制性巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和中性粒细胞生长与功能，抑制T细胞和树突状细胞，并通过表观遗传调节及hypusinated eIF5A促进髓系细胞M2极化；LASSO选择的PMN多胺代谢基因（ODC、SMOX、PAOX、OAT）表达升高与免疫治疗不良应答相关。相反，PBMCs中谷氨酰胺相关基因（GLS、OAT、ALDH18A1）表达升高与良好应答相关，与活化效应CD8⁺ T细胞以谷氨酰胺分解作为多胺主要碳源的报道一致。PMN多胺基因表达与血浆Cit H3及免疫治疗不良应答相关，ATP13A3和Cit H3在NETosis刺激中性粒细胞表面的早期表达及Trimer44NMe PTI抑制NETosis提示多胺输入参与NET形成。PBT抑制Dox诱导的转移和NETs，提示其可能用于降低Cit H3升高及循环PMN多胺基因表达升高患者的转移和肿瘤进展；未来需研究PTI抑制NETosis在PBT逆转ICI耐药中的作用。局限性包括患者队列涵盖多癌种、ICI方案异质、部分亚组很小、无法可靠按癌种分层、残余混杂不能完全排除，结果属探索性和假设生成性，需在更大疾病特异性队列中验证。研究结论翻译：总之，本研究提示白细胞亚群中NETosis与多胺基因表达之间存在机制联系，可能作为预测癌症患者治疗应答的外周血生物标志物；在外周血中使用这些NETosis和多胺代谢生物标志物可能加速新型或现有药物新适应证的批准。