《Frontiers in Immunology》：Neutrophil–microglia communication through the C3–C3aR1 axis contributes to secondary neuroinflammation after traumatic brain injury
编辑推荐：
背景：创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）触发快速演变的神经炎症反应，促进继发性脑损伤。尽管浸润性白细胞和常驻小胶质细胞均是这一反应的重要组分，但连接外周免疫细胞募集与小胶质细胞状态重塑的细胞信号尚未完全明确。方法：研究人员整合
背景：创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）触发快速演变的神经炎症反应，促进继发性脑损伤。尽管浸润性白细胞和常驻小胶质细胞均是这一反应的重要组分，但连接外周免疫细胞募集与小胶质细胞状态重塑的细胞信号尚未完全明确。方法：研究人员整合并重新分析了公开的小鼠TBI模型单细胞RNA测序数据集，以定义脑细胞组成和转录状态的时间变化。使用CellChat和NicheNet优先筛选候选的中性粒细胞至小胶质细胞信号通路。通过免疫荧光和流式细胞术评估C3和C3aR1的预测细胞分布。在小鼠TBI模型中检测了JR14a处理对小胶质细胞炎症反应、血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）完整性和神经学结局的影响。使用单细胞调控网络推断和聚类（Single-Cell rEgulatory Network Inference and Clustering，SCENIC）、CellOracle（一种基因调控网络推断和计算机模拟转录因子扰动框架）和scTenifoldKnk（一种基于单细胞基因调控网络的虚拟敲除框架）对C3ar1高表达小胶质细胞进行基因调控网络推断和计算机模拟转录因子扰动分析。结果：对254,512个细胞的分析揭示了TBI急性期浸润性中性粒细胞的短暂增加和炎症性小胶质细胞状态的出现。CellChat和NicheNet均独立地优先筛选出中性粒细胞与Microglia4之间的C3相关信号。C3表达在浸润性中性粒细胞中富集，而C3ar1优先在炎症性小胶质细胞中表达。流式细胞术显示，C3aR1阳性小胶质细胞比C3aR1阴性小胶质细胞表达更高水平的IL-1β和TNF-α。JR14a处理减少了小胶质细胞炎症性细胞因子的产生，保留了Claudin-5的表达，限制了伊文思蓝外渗，并改善了TBI后的神经和认知结局。探索性调控分析进一步优先筛选出Ets2、Fosl2和Irf7作为C3ar1高表达小胶质细胞程序的候选调控因子。结论：这些发现提示中性粒细胞相关的C3/C3a–C3aR1通讯通路参与TBI后的炎症性小胶质细胞重塑，并支持进一步研究C3aR1相关信号作为继发性神经炎症的治疗靶点。
创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是全世界死亡和长期神经功能障碍的主要原因。初始机械损伤后继发的神经炎症、氧化应激、血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）破坏和神经元功能障碍等过程在伤后数小时至数天内演变，显著影响组织丢失和神经功能恢复。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，在TBI后发生剧烈的转录和功能改变，呈现从修复性到高度炎症性的多种激活状态。外周免疫细胞浸润是急性TBI的显著特征，其中中性粒细胞是最早募集的细胞之一，但传统上被视为组织损伤的直接效应细胞。近年证据表明，中性粒细胞也可通过细胞因子和配体–受体信号调节中枢常驻细胞反应，然而浸润性中性粒细胞是否主动调控TBI后小胶质细胞表型转变及其分子机制仍不清楚。因此，研究人员开展了这项研究。
研究人员整合并重新分析了公开的小鼠TBI单细胞RNA测序数据集（包含对照组、TBI1d和TBI7d，共254,512个细胞），结合细胞–细胞通讯分析、免疫荧光和流式细胞术验证以及药理学干预，系统研究了TBI后中性粒细胞与小胶质细胞之间的通讯。研究发现，中性粒细胞相关的C3/C3a–C3aR1信号轴可能介导了炎症性小胶质细胞重塑，且药理学调节该通路可减轻小胶质细胞炎症、保护BBB完整性并改善神经和认知结局。该研究为理解TBI后继发性神经炎症的细胞间通讯机制提供了新视角，并支持C3aR1相关信号作为潜在治疗靶点。
研究人员从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库获取公开的小鼠TBI单细胞RNA测序数据（GSE269748和GSE290150），其中对照组10个样本、TBI1d组9个样本、TBI7d组3个样本。使用Seurat进行质量控制、聚类分析，Harmony进行批次校正。采用CellChat和NicheNet预测中性粒细胞至小胶质细胞的候选信号通路。通过免疫荧光和流式细胞术验证C3和C3aR1的细胞分布。使用控制性皮质撞击（controlled cortical impact，CCI）模型构建小鼠TBI，并在伤后1小时内给予JR14a处理，检测炎症因子、BBB通透性和行为学。利用SCENIC、CellOracle和scTenifoldKnk进行基因调控网络推断和计算机模拟转录因子扰动分析。
2.1 单细胞转录组分析揭示TBI后动态免疫重塑：通过整合分析254,512个细胞，鉴定出主要脑细胞群，发现TBI1d时单核/巨噬细胞和中性粒细胞显著增加，TBI7d时中性粒细胞比例下降。差异表达基因和基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析显示，急性期富集白细胞迁移、炎症调节和凋亡信号等程序，后期转向RNA加工、细胞呼吸和氧化磷酸化等代谢程序，提示TBI伴随细胞类型特异的动态免疫重塑。
2.2 TBI诱导异质性小胶质细胞状态重塑：对小胶质细胞重新聚类得到7个转录上不同的亚群，其中Microglia3和Microglia4在TBI1d显著扩增，并具有较高炎症评分；TBI7d亚群则脂质代谢评分升高。Monocle2拟时间轨迹分析显示小胶质细胞从稳态（Microglia2）向炎症和代谢重塑状态（Microglia3/4）转变。分支表达分析建模（Branched Expression Analysis Modeling，BEAM）在分支点5识别出590个分支依赖性基因，涉及炎症、生物合成和代谢程序，表明TBI驱动小胶质细胞状态转变与急性炎症激活紧密耦合。
2.3 细胞通讯分析鉴定中性粒细胞相关C3信号靶向活化小胶质细胞状态：CellChat分析显示，TBI1d时中性粒细胞到小胶质细胞亚群（尤其Microglia2/3/4）的外向通讯增加，并富集THBS1-SDC4、CCL3/CCL4-CCR5和C3-C3aR1等配体–受体对。NicheNet分析将C3列为优先候选配体。C3表达在浸润中性粒细胞中富集，而C3ar1在小胶质细胞亚群中沿拟时间轨迹动态表达。C3ar1高表达小胶质细胞表现出更强的炎症程序。进一步调控网络分析优先筛选出Ets2、Fosl2和Irf7作为候选转录调控因子。
2.4 JR14a处理减弱小胶质细胞炎症激活并保护BBB完整性：免疫荧光显示，TBI后IBA1阳性小胶质细胞中C3aR1免疫反应性增加，浸润中性粒细胞中C3表达增加。流式细胞术证实，TBI后CD45intCD11b+C3aR1+小胶质细胞增加，且C3aR1+小胶质细胞中IL-1β和TNF-α表达高于C3aR1-小胶质细胞。JR14a处理减少了C3aR1+小胶质细胞中IL-1β和TNF-α表达，保留了Claudin-5表达，并减少了伊文思蓝外渗，提示该通路与BBB保护相关。
2.5 JR14a处理改善TBI后神经和认知结局：行为学测试显示，JR14a处理显著降低了TBI后1、3、7天的改良神经严重程度评分（modified neurological severity score，mNSS），改善了转棒表现；在莫里斯水迷宫（Morris water maze，MWM）测试中，JR14a处理缩短了逃避潜伏期，增加平台穿越次数，且不影响游泳速度，表明空间学习和记忆得到改善。
讨论部分指出，TBI急性期以中性粒细胞短暂浸润和炎症性小胶质细胞扩增为特征，中性粒细胞可能作为信号细胞而非单纯效应细胞。补体激活是TBI后二次损伤的重要环节，C3通过C3aR1信号促进炎症和神经血管功能障碍。本研究将浸润中性粒细胞确定为C3的潜在局部来源，但尚不能区分中性粒细胞来源C3与其他来源（如循环C3和肝源C3）的相对贡献，需要细胞特异性遗传学模型进一步验证。JR14a的药理学作用与小胶质细胞炎症减轻和BBB保护相关，但系统给药不能确立小胶质细胞特异性机制。计算分析优先的Ets2、Fosl2和Irf7仅提供关联和候选优先性，需实验验证。研究结论为：这些发现提示中性粒细胞相关的C3/C3a–C3aR1通讯通路参与TBI后的炎症性小胶质细胞重塑，并支持进一步研究C3aR1相关信号作为继发性神经炎症和神经血管功能障碍的治疗靶点。
