《Frontiers in Immunology》：Extracellular vesicle-based drug delivery in pediatric immune thrombocytopenia
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摘要：儿童免疫性血小板减少症（pediatric ITP）是一种获得性免疫介导性疾病，由针对血小板表面糖蛋白的自身抗体产生所触发，导致脾脏内血小板破坏及骨髓中巨核细胞生成受损。这一免疫应答因涉及T细胞增殖、促炎性巨噬细胞极化以及间充质基质细胞（MSCs）免疫调
摘要：儿童免疫性血小板减少症（pediatric ITP）是一种获得性免疫介导性疾病，由针对血小板表面糖蛋白的自身抗体产生所触发，导致脾脏内血小板破坏及骨髓中巨核细胞生成受损。这一免疫应答因涉及T细胞增殖、促炎性巨噬细胞极化以及间充质基质细胞（MSCs）免疫调节功能缺陷的失调性炎症环境而进一步恶化。尽管一线疗法如静脉注射免疫球蛋白G和皮质类固醇仍具疗效，但其伴随显著的毒性反应，且未能完全解决儿科患者疾病的系统性特征。目前，由各类细胞分泌的作为细胞介质的细胞外囊泡（EVs）正被研究作为有前景的治疗性纳米载体。特别是间充质干细胞来源的细胞外囊泡（MSC-EVs），因其低免疫原性、高生物相容性以及内在的携带可调节免疫应答的货物能力，已成为治疗候选物。MSC-EVs可能同时调控T细胞平衡、影响巨噬细胞极化、支持巨核细胞生成，并将调节性分子递送至特定靶点。涉及货物装载和表面功能化的生物工程策略可进一步提升其治疗潜能和归巢能力。尽管临床转化仍面临关键障碍，MSC-EVs代表了儿童ITP精准无细胞治疗的一个有前景的平台。虽然直接的儿科特异性证据仍然有限，本综述全面概述了MSC-EVs的生物学特性、免疫调节机制及转化挑战，并将其优势与传统药理学方法及其他现有合成纳米载体进行了比较。
1 引言
儿童免疫性血小板减少症（pediatric ITP）是一种获得性免疫介导性疾病，也是儿童血小板减少的最常见原因，其特征为1至18岁儿童血小板计数低于100×109/L，由自身抗体介导的血小板破坏和血小板生成受损所致。ITP的发病机制涉及多方面因素，包括对血小板和巨核细胞抗原的免疫耐受丧失、自身反应性T/B淋巴细胞扩增、巨噬细胞介导的血小板吞噬增强以及骨髓中巨核细胞生成受抑。此外，辅助性T细胞（Th）1/Th2和Th17/调节性T细胞（Treg）平衡失调有助于建立促炎环境，从而维持自身免疫性血小板破坏。ITP依据病程长短分类：新诊断（3个月内）、持续性（3至12个月）和慢性（超过12个月）。临床表现从无症状或轻微瘀伤到严重危及生命的出血不等。约70%以上的患儿在确诊后六个月内自发恢复，但高达30%发展为慢性ITP。治疗决策主要依据出血和临床表现严重程度，而非单纯血小板计数。一线治疗包括静脉注射免疫球蛋白G（IVIG）或大剂量皮质类固醇。二线药物用于持续性或慢性ITP伴显著出血者，包括血小板生成素受体激动剂（TPO-RAs）（如艾曲泊帕、阿伐曲泊帕和罗米司亭）、免疫抑制剂（如吗替麦考酚酯MMF、西罗莫司）以及利妥昔单抗。脾切除术仅在极特殊情况下的儿童中考虑。所有现有疗法均存在局限性和严重不良反应，这凸显了对新型治疗方法的探索需求。在此背景下，细胞外囊泡（EVs）作为具有固有免疫调节特性的生物纳米载体应运而生。EVs是由脂质双层膜界定的颗粒，由所有细胞类型释放，具有低免疫原性、生物相容性和穿越生物膜的能力。本综述旨在总结EVs作为潜在药物递送和无细胞治疗选项在儿童ITP中的应用现状，重点探讨MSC来源EVs（MSC-EVs）相较于其他平台的独特优势。
2 细胞外囊泡：生物学与分类
EVs最初被视为细胞清除废物的方式，现已知其在细胞间通讯中发挥关键作用。根据MISEV2023指南，建议统一使用“细胞外囊泡”这一术语。EVs携带来自母细胞的多种生物活性分子，包括蛋白质、脂质和核酸（如microRNA、mRNA等）。即使在同一细胞类型内，EV群体也具有异质性。EVs具有固有的稳定性、低免疫原性、生物相容性、延长半衰期和穿越生物屏障的能力，可作为无细胞治疗替代方案、药物和基因递送系统。
2.1 EVs的来源及其免疫调节功能
EVs通过直接影响靶免疫细胞激活下游信号，或间接转运microRNAs（miRNAs）来发挥免疫调节作用。不同免疫细胞来源的EVs功能各异：树突状细胞（DCs）和B细胞来源的EVs可直接刺激T细胞增殖和细胞因子产生；T细胞来源的EVs参与抗病毒和抗肿瘤活性；巨噬细胞来源的EVs根据极化和货物类型发挥抑制或刺激作用。在ITP中，B细胞来源的EVs携带致病性货物，包括负载自身抗体的免疫复合物和促炎miRNAs，进一步放大针对血小板的体液免疫应答。
2.2 MSC来源EVs在ITP中的作用机制与治疗潜力
间充质干细胞（MSCs）是多能干细胞，可从骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织和牙髓等多种来源分离。MSCs通过与免疫细胞相互作用调节先天性和适应性免疫应答，例如驱动巨噬细胞向抗炎M2表型极化、调节Th1/Th2平衡、影响自然杀伤（NK）细胞和B细胞功能。然而，从ITP患儿骨髓中分离的MSCs表现出功能受损，包括增殖能力降低、凋亡和衰老增加，以及免疫抑制活性减弱。由于ITP患者的MSCs功能缺陷，直接自体细胞治疗往往无效。健康同种异体MSC来源产物（如MSC-EVs）成为更优策略。MSC-EVs作为生理性无细胞治疗方法，具有高产率、广泛功能和广阔临床应用前景，但需在良好生产规范（GMP）条件下标准化生产。此外，MSC-EVs还可作为新型诊断工具，EV相关基因在ITP患者中差异表达，可作为疾病监测和治疗反应的候选生物标志物。
3 内源性货物与工程化策略
EVs的治疗功效由其运输至靶细胞的分子决定。天然状态下，MSC-EVs携带源自母细胞的分子特征，对稳态免疫调节至关重要。最常研究的分子是miRNAs，如miR-146a-5p和miR-199a-5p可通过抑制NF-κB通路促进巨噬细胞M2极化并改善Th17/Treg比值。EVs还含有程序性死亡配体-1（PD-L1）、半乳糖凝集素-1和转化生长因子-β（TGF-β）等调节外周耐受的蛋白质。然而，内源性EVs在ITP中也具有致病作用，如血浆来源EVs可通过Bcl-xL/caspase信号调节血小板生成，而miR-363-3p水平升高会削弱Tregs抑制Th1细胞的能力。
3.1 装载方法与表面修饰
生物工程策略通过三种主要方式改造EVs：内源性装载（在收集前将治疗性货物载入母细胞）、外源性装载（分离后直接将货物插入EVs）和表面功能化。内源性装载利用细胞天然分选机制，常用方法包括转染和电穿孔。外源性装载方法包括电穿孔、超声处理和冻融循环，但可能导致表面蛋白变性和膜完整性破坏。表面修饰旨在实现靶向递送，如通过肽展示、抗体偶联和遗传融合等方法，可显著改善组织特异性生物分布和治疗效果。
4 从MSC细胞治疗到MSC-EV药物递送
尽管MSCs的临床应用日益广泛，但在ITP中的应用受到患者来源MSCs功能缺陷和全细胞输注风险的限制。MSCs的低免疫原性源于MHC I类分子的低表达以及MHC II类和共刺激分子的缺失。从全细胞MSCs治疗转向MSC-EVs治疗解决了细胞治疗的若干局限性，复制了母细胞的旁分泌免疫调节功能，同时消除了完整细胞输注的相关风险。MSC-EVs可通过恢复T细胞稳态、促进巨噬细胞M2极化以及改善骨髓微环境支持巨核细胞生成和血小板生成来发挥免疫调节作用。
5 儿童ITP治疗平台比较
为了界定EVs在儿童ITP中的转化生态位，本文比较了合成纳米载体与MSC-EVs。血小板膜包被纳米颗粒（PNPs）作为诱饵吸收致病性抗血小板抗体，但属单靶点策略，未解决更广泛的免疫失调。脂质体和脂质纳米颗粒（LNPs）虽已用于药物递送，但面临免疫识别和清除等问题。相比之下，MSC-EVs继承母细胞膜蛋白的全套谱系，包括CD47等表面信号，赋予延长循环时间和组织特异性靶向能力，无需合成聚乙二醇（PEG）化即可避免相关的免疫学负担。这种天然靶向能力对于ITP尤为重要，因为治疗作用必须同时到达脾脏（血小板破坏的主要部位）和骨髓（巨核细胞生成障碍部位）。
6 临床转化与正在进行中的试验
截至2026年7月28日，ClinicalTrials.gov上注册了一项正在进行的关于MSCs治疗难治性原发性ITP的临床试验（NCT06813157），但尚无基于EVs的疗法在儿童ITP中进行试验。在儿童其他疾病领域，共有34项关于EVs的研究正在进行中，涵盖神经、肺部、胃肠道等多个领域。
7 EVs的局限性
EVs的临床应用仍面临重大挑战，包括工程化EVs的异质性、规模化生产需满足GMP标准、给药途径的选择（静脉注射最常用，腹腔注射在动物模型中广泛使用，口服给药可行性初显）、分离纯化困难（超速离心产量高但纯度低，尺寸排阻色谱纯度高但回收率低，切向流过滤可实现规模化GMP处理，免疫亲和捕获特异性高但通量低）、储存稳定性问题（-80℃可保存6个月，冷冻干燥联合海藻糖作为冷冻保护剂显示前景）。此外，EVs的双重性质构成最大的转化风险——既是治疗剂又是致病介质，如ITP患者血浆和B细胞来源EVs携带的致病性货物可能加重疾病。因此，需建立多层验证框架：通过分子表征明确货物组成、进行功能性效力测定、在GMP条件下标准化生产和分离。
7.1 基于EVs的疗法在儿童ITP中的局限性
尽管讨论了EVs在ITP中的机制和治疗证据，但这些研究完全来自成人患者或小鼠模型，目前尚无关于儿童ITP中EVs疗法的直接证据。儿童ITP与成人疾病存在显著差异，包括更高的自发缓解率、不同的慢性化时间模式、对仍在发育的免疫系统的不同影响，以及倾向于延迟使用侵袭性二线治疗的策略。骨髓微环境本身在儿童和成人之间可能存在差异。因此，MSC-EVs在儿童中引发的免疫调节反应的幅度和质量不能假定与成人相同，剂量、MSC来源、供体变异性和给药时机等因素在儿科环境中完全未定义。填补这一空白需要专门的儿科ITP队列研究、年龄匹配的疾病模型以及最终的控制性临床试验。
8 潜在发展与未来展望
细胞外囊泡代表了一种新颖且有前景的儿童ITP治疗方法，其独特的生物学特性使其优于传统药理学方法和合成纳米载体。MSC-EVs可同时恢复T细胞平衡、促进巨核细胞生成和重建骨髓微环境，以目前任何疗法都无法实现的方式应对ITP复杂的多层面病理生理学。然而，在临床实践转化之前，必须解决EV群体的异质性、大规模生产的可重复性、标准化货物装载方案的缺乏、质量控制生物标志物的验证不足以及监管框架的初步阶段等重大障碍。未来研究应优先发展可规模化制造平台、鉴定与治疗功效相关的特异性miRNA和蛋白质货物特征，以及设计充分的随机临床试验，以最终确立EVs疗法在儿童人群中的安全性和有效性。
