棉花与寄主互作综合评估及抗枯萎病4号生理小种（FOV4）多基因抗性的基因组鉴定

《Crop Science》：Comprehensive assessment of host–plant interaction and genomic identification of multi-genic resistance to Fusarium wilt race 4 (FOV4) in cotton

　　

现有及新出现的病害威胁要求持续鉴定和培育能够更有效抵御毁灭性病原体的栽培品种。二十年来，引起棉花枯萎病的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum，FOV）4号生理小种（FOV4）一直威胁着美国加利福尼亚州圣华金河谷（San Joaquin Valley）的棉花（Gossypium spp.）生产，近年来又在新墨西哥州和得克萨斯州埃尔帕索（El Paso, TX）地区造成危害。本研究采用综合性遗传数量性状位点（QTL）定位和基因组寄主-植物互作研究策略，鉴定了与棉花枯萎病抗性相关的简单序列重复（SSR）和单核苷酸多态性（SNP）标记及一组生物标志候选基因。研究结果揭示了抗性超亲分离个体——A和D亚基因组中基因祖先形式间的祖先互易重排和重复，尤其是A02和A03染色体，以及A03与D02之间的易位——以及FOV4抗性的复杂性。此外，QTL分析表明，对FOV4抗性贡献最大（占维管束根部染色（VRS）变异的29%–61%）的位点位于A02（qtlA02-Fov41）和D03（qtlD03Fov41）染色体上。与增强苯丙烷代谢相关的基因及已鉴定的表达基因是解析多基因型病害抗性的研究靶标，为标记辅助选择和/或基因组选择的新策略提供了机会。研究最终提出了一组与棉花FOV4抗性相关的推定QTL标记和数量性状差异表达基因位点（QTDEL），可用于在自然感染FOV4的田间条件和温室人工接种条件下鉴定和选择抗性表型。这一新方法也可应用于其他病原-寄主系统。

论文解读

一、研究背景与目的

棉花是全球最重要的可再生天然纺织纤维来源，也是植物油的主要来源之一。然而，由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum，FOV）4号生理小种（FOV4）引起的棉花枯萎病，近二十年来持续威胁美国棉花生产。该病害最初在加利福尼亚州圣华金河谷造成严重危害，2017年在得克萨斯州埃尔帕索地区、2019年在新墨西哥州相继被正式确认，其蔓延态势已引起美国棉花产业的高度关注，尤其是该病原菌已逼近美国最大的陆地棉产区——西得克萨斯高地平原。

FOV4是一种土壤习居真菌，可在无寄主条件下长期存活，几乎不可能从田间根除。培育抗FOV4品种是应对该病害及其产量损失的唯一有效且经济可行的途径。此前的研究表明，棉花对FOV的抗性由一至两个主效基因（具有完全或不完全显性）以及可能存在的微效基因共同决定。两个主效基因（Fov4和FW^R）已被定位在D03染色体上。然而，不同遗传背景的抗性品种在面临不同地理来源的生理小种时，其抗性遗传模式可能存在差异，FOV抗性涉及的基因调控网络十分复杂。

近年来棉花基因组资源大幅增加，祖先二倍体（A和D）及四倍体陆地棉和海岛棉的基因组均已发布，这为更好地鉴定重组事件和性状关联选择信号、促进包括抗病性在内的农艺性状改良基因发现提供了重要机遇。基于此，研究人员开展了一项综合性遗传QTL定位和基因组寄主-植物互作研究，旨在：（1）加深对棉花FOV抗性的理解；（2）利用新型遗传和QTL定位分析检测与FOV4抗性相关的基因组区域；（3）鉴定与FOV4抗性相关的分子标记；（4）鉴定一组参与FOV、FOV4及其他土传病原菌感染响应的推定数量性状差异表达基因（QTDEL）。

二、主要关键技术方法

本研究使用了两个重组自交系（RIL）作图群体：群体1（Pop1）为陆地棉TM-1（G. hirsutum）×海岛棉3-79（G. barbadense）种间杂交群体，含90个RIL；群体2（Pop2）为以D03染色体（原17号染色体）替换的染色体置换系CS-B17与轮回亲本TM-1构建的群体，含50个RIL。表型评价涵盖5个独立试验（1个天然感染FOV4的田间试验和4个温室人工接种试验），采用病害严重度指数（DSI）和维管束根部染色（VRS）0–5级分级标准。基因分型方面，Pop1使用约2500个SSR标记和15846个SNP标记，Pop2使用500个D03染色体SNP标记。分析策略包括：单标记分析（Kruskal–Wallis非参数检验）、GWAS标记-性状关联分析、多QTL模型（MQM）作图、标记序列与参考基因组比对定位、基因本体（GO）富集分析，以及基于RNA-seq的差异表达基因（DEG）分析（采用DNASTAR和kallisto/edgeR两种独立流程）。RNA-seq数据来自抗性品种Pima-S6、感病品种Pima 3-79、中度感病TM-1和感病Shorty四个基因型接种FOV4（CA-14分离株）后的根部样本。

三、研究结果

3.1 FOV4表型评估

在两个RIL群体中均观察到广泛的VRS等级变异。Pop1群体在田间FKCA位点VRS平均值为2.4（范围0.0–4.0），温室UCD位点平均值为1.5（范围0.0–4.0），温室UCK位点平均值为1.3（范围0.0–3.0）。Pop2群体在UCK位点VRS平均值为2.6（范围1.0–5.0），UCR位点平均值为4.0（范围0.8–5.0）。方差分析（ANOVA）显示各试验位点内DSI和VRS均存在显著差异（p < 0.05），表明群体具有充分的表型变异。部分RIL表现出超亲分离现象，即抗性或感病程度超过双亲。Pop2群体中UCK与UCR位点间的遗传相关性为r = 0.70，广义遗传力分别为H² = 0.53（UCK）和H² = 0.68（UCR），表明各RIL的FOV4抗性水平在不同环境下基本保持一致。

3.2 遗传作图

Pop1群体高密度遗传连锁图包含15846个SNP标记，平均单标记bin间隔为1.1 cM。Pop2群体由于标记多态性主要集中于D03染色体，最终仅构建了包含500个SNP的D03连锁群，单标记bin间隔为1.02 cM。Pop2群体在其他染色体（如A01、A02、A03、A11、D01、D09和D11）上也观察到少量标记分离，这可能源于CS-B17品系回交选育过程中的残余片段携带。

3.3 QTL分析第一步

通过GWAS/标记-性状关联分析和单标记非参数检验，在Pop1中检测到超过100个与VRS相关的SSR标记关联和超过120个SNP标记-QTL；在Pop2中检测到超过140个与VRS相关的推定QTL。这些标记关联在多个群体或多个试验位点中被重复检测到，或单一位点检测的p值小于0.00005，表明检测结果具有较高的可靠性。

3.4 标记选择与Pima-S6参考基因组定位

从两个群体中筛选出277个唯一标记（69个SSR和208个SNP），通过DNA序列比对将其定位于Pima-S6参考基因组。在A亚基因组中，264个标记分布于13条染色体，其中A02（113个）、A03（29个）、A10（29个）和A11（52个）含标记关联数最多；在D亚基因组中，277个标记分布于13条染色体，其中D02（15个）、D03（153个）、D10（19个）和D11（48个）含标记关联数最多。研究确认了四倍体棉花A和D亚基因组间祖先互易重排和重复的存在，特别是A02、A03与D03染色体之间的结构变异，以及A03与D02之间的祖先易位。部分定位于D03的标记在非同源染色体（如A01、A11、D10）上也存在第二匹配位置，进一步揭示了棉花基因组的复杂性。

3.5 QTL分析第二步

通过MQM程序在两个RIL群体中鉴定并验证了两个主效QTL。第一个QTL位于A02染色体约101,650,000–102,010,000 Mb区间（Pop1中i52902Gb–i14824Gh标记间，Pop2中i03198Gh–i55318Gb标记间），解释VRS变异的29%–61%，LOD值为5.8–8.9，加性效应为0.44–0.60，命名为qtlA02-Fov4₁。第二个QTL位于D03染色体约1,962,000–2,288,000 Mb区间（Pop1中i43570Gh–i03180Gh标记间，Pop2中i43570Gh–i18518Gh标记间），解释相似比例的VRS变异和加性效应，命名为qtlD03Fov4₁。此外还检测到多个微效QTL：D03染色体端粒区（约0.600000 Mb）由DPL0510 SSR标记检测的QTL解释18%的VRS变异（LOD 3.3）；D03染色体4,278,000–5,477,000 Mb区间（i55870Gb–i52303Gb标记间）的QTL解释29.6%的VRS变异（LOD 3.4）；D03染色体48,068,000–49,535,000 Mb区间（i03445Gh–i03474Gh标记间）的QTL解释10%的VRS变异（LOD 1.9）。其他染色体上也检测到多个微效QTL，包括A01、A03、A10、A11、D01和D02等。

四、讨论与结论

本研究通过将QTL定位、标记物理作图、GO富集分析和RNA-seq差异表达分析相结合，建立了一套系统的QTDEL鉴定流程。在A亚基因组中，A02（15个）、A03（5个）、A11（13个）和A10（6个）染色体上鉴定出与FOV4抗性相关的差异表达基因-标记组合；在D亚基因组中，D03（19个）、D11（8个）、D02（3个）和D10（3个）染色体上鉴定出相应的QTDEL。其中，与增强苯丙烷代谢相关的基因被确定为重要的研究靶标，这些基因在抗性品种Pima-S6中表现出差异表达，与先前报道的增强根部苯丙烷代谢决定FOV4抗性的结论一致。

研究结论表明，棉花对FOV4的抗性是由多基因控制的复杂性状，主效QTL位于A02和D03染色体上，同时多个微效QTL和不同染色体上的候选基因共同参与抗性调控。研究提出的推定QTL标记和QTDEL基因集可用于在自然感染FOV4的田间条件和温室人工接种条件下鉴定和选择抗性棉花表型，为标记辅助选择（MAS）和/或基因组选择（GS）提供了新的策略。该综合研究方法同样可推广应用于其他病原-寄主系统。