黑色素瘤CD109下调通过诱导效应期肿瘤浸润淋巴细胞抵抗减弱免疫检查点抑制剂疗效

《JID Innovations》：CD109 downregulation in melanoma attenuates responses to immune checkpoint inhibitors by inducing resistance to tumor-infiltrating lymphocytes during the effector phase

　　

免疫检查点抑制剂（ICIs）可延长黑色素瘤患者生存，但获得性耐药频繁出现。尽管黑色素瘤细胞中因B2M序列变异导致的主要组织相容性复合体I类（MHC-I）表达缺失代表难以克服的获得性耐药，其他耐药机制仍可能被克服。本研究利用基于自体黑色素瘤细胞-TILs配对的体外筛选系统，综合探索黑色素瘤细胞在保留MHC-I时对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）产生抵抗的机制。CD109被鉴定为参与该耐药机制的候选分子。在对142例临床样本的事后分析中，黑色素瘤细胞CD109表达较低与ICIs效果降低相关。CD109组间性别分布存在差异，但在多变量Cox分析中并非独立预后因素。体外实验显示，CD109表达降低显著减弱TILs对肿瘤细胞刺激的活化反应，并降低TILs介导的细胞裂解，提示CD109支持TILs对黑色素瘤细胞的效应应答。CD109曾被报道为负性转化生长因子β（TGF-β）调节因子；然而，TGF-β对TIL活性的影响并不依赖CD109表达。这些发现支持CD109在黑色素瘤ICI耐药中的作用。仍需在独立临床队列中进一步验证。

研究背景与问题：免疫检查点抑制剂（ICIs）已改善包括黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌和Merkel细胞癌在内的多种皮肤癌预后，但黑色素瘤中不足一半患者可获得持续超过10年的持久获益。抗PD-1/PD-L1和/或抗CTLA-4抗体虽已重塑辅助、新辅助及转移阶段的治疗标准，长期疾病控制仍不一致。细胞毒性CD8⁺ T淋巴细胞（CTLs）是抗肿瘤免疫的核心效应细胞，通过T细胞受体（TCR）识别主要组织相容性复合体I类（MHC-I）提呈的肿瘤抗原，并经颗粒胞吐和细胞因子释放清除靶细胞；持续抗原刺激可诱导以效应功能下降和程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）持续表达为特征的耗竭状态。PD-1与其配体PD-L1/PD-L2结合可减弱TCR信号并抑制细胞毒活性，阻断PD-1/PD-L1轴可恢复抗肿瘤反应。ICI耐药分为原发性和获得性；获得性耐药机制包括干扰素γ（IFN-γ）信号通路异常（如JAK1、JAK2序列变异）、抑制性免疫检查点上调以及B2M序列变异所致MHC-I丢失。MHC-I丢失是决定性的肿瘤免疫逃逸机制，可使肿瘤特异性T细胞完全无效。研究人员认为，在不可逆MHC-I丢失尚难克服的背景下，阐明其他可逆且可处理的免疫逃逸机制更为重要。既往研究建立了由B2M序列变异导致MHC-I丢失的黑色素瘤细胞与来自ICI获得性耐药患者的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）组成的自体配对；该TILs不能识别复发肿瘤细胞，而恢复野生型B2M后肿瘤细胞可被TILs强烈识别。本研究据此建立体外实验系统，以诱导MHC-I丢失之外的肿瘤免疫逃逸机制，并将MHC-I恢复的肿瘤细胞与TILs共培养，回收存活且未丢失MHC-I的肿瘤细胞，与共培养前细胞进行基因表达谱比较，从显著变化基因中选择CD109进行验证，以探讨其作为癌症免疫治疗潜在靶点、ICIs疗效预测生物标志物及免疫逃逸机制线索的意义。

研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员利用MEL01自体黑色素瘤细胞-TILs配对建立MHC-I保留的TILs抵抗细胞系，鉴定CD109为候选介导分子，并在临床样本及体外功能实验中验证CD109与ICI疗效及TIL效应功能的关系。研究结论为：CD109缺失可在肿瘤细胞保留MHC-I表达的情况下减弱TIL活化和杀伤，肿瘤细胞低CD109与ICI治疗后较差结局相关，支持CD109在黑色素瘤ICI耐药中的作用；MHC-I重建与选择平台是实用的体外筛选系统，具有发现其他临床可处理的识别后抵抗机制的潜力。其意义在于提出CD109作为ICI耐药相关分子及潜在生物标志物，并强调需在独立临床队列中进一步验证。

关键技术方法（不超过250字）：研究采用自体黑色素瘤细胞-TILs配对（MEL01）及独立临床队列。MEL01来自一位50岁早期女性左侧拇指黑色素瘤患者，抗PD-1治疗后淋巴结进展灶切除后建立MHC-I缺失肿瘤细胞和TILs；经野生型B2M转导恢复MHC-I后与自体TILs短期共培养筛选抵抗亚系。另用526mel细胞（美国NCI-SB）与HLA-A*02:01/MART-1匹配的MEL C6 TILs验证。临床队列为2014—2020年多中心142例接受ICIs（抗PD-1和/或抗CTLA-4）的黑色素瘤患者FFPE样本。方法包括DNA微阵列、CRISPR/Cas9敲除、流式细胞术、ELISA检测IFN-γ/TGF-β1、钙黄绿素释放细胞毒试验、TGF-β调节实验及CD109免疫组化。

研究结果：
（1）建立保留MHC-I且对TILs抵抗的黑色素瘤细胞系并鉴定CD109为候选介导分子：MEL01患者为50岁早期女性，左侧拇指色素性病变诊断为黑色素瘤，行左拇指截肢和腋窝淋巴结清扫，后出现左锁骨上及副神经淋巴结转移；帕博利珠单抗治疗获部分缓解，随后左副神经淋巴结增大。研究人员从切除淋巴结建立自体肿瘤细胞系和TILs，发现肿瘤细胞因B2M基因序列变异完全丢失MHC-I并获得性耐药； reintroduction野生型B2M恢复MHC-I表达并使自体TILs强识别（MEL01-B2M）。将MEL01-B2M与自体TILs共培养，获得保留MHC-I且存活的抵抗细胞系MEL01-B2M-R；流式确认亲本MEL01无MHC-I、MEL01-B2M恢复、MEL01-B2M-R维持；细胞毒试验显示MEL01-B2M-R较MEL01-B2M更不易被TILs杀伤。微阵列比较MEL01-B2M与MEL01-B2M-R，在MEL01-B2M-R中降至<20%的9个基因中优先选择CD109，其为细胞表面蛋白且在当时癌症免疫中作用不清。
（2）黑色素瘤细胞低CD109表达与ICI治疗后较差临床结局相关：对142例接受ICI治疗的黑色素瘤患者FFPE样本行CD109免疫组化，以6个月无进展生存（PFS）为终点通过接收者操作特征（ROC）曲线确定cutoff，分为CD109-low（n=96）和CD109-high（n=46）。未校正分析中，CD109-high组PFS较长，总生存（OS）也倾向较长但未达统计学显著，客观缓解率较高；对PFS、OS和客观缓解率三项临床终点行Bonferroni校正后，均未达校正显著性阈值（p<0.0167）。多变量Cox比例风险分析显示，CD109表达、体能状态、疾病分期和血清乳酸脱氢酶（LDH）为PFS和OS的独立预后因素，性别不是独立预后因素。CD109-low组可用转移标本中未观察到MHC-I完全丢失；用MEL01-B2M与MEL01-B2M/CD109-KO细胞块验证CD109染色特异性，并用MEL01（MHC-I丢失）与MELS（MHC-I保留）验证MHC-I染色。
（3）黑色素瘤细胞CD109缺失减弱TILs对肿瘤细胞刺激的活化和TILs介导的细胞毒性：研究人员用CRISPR-Cas9生成MEL01-B2M/CD109-KO细胞，流式确认CD109表达在MEL01-B2M-R中降低、在KO中进一步降低；PD-L1、CD155和CD276表面表达在MEL01-B2M、MEL01-B2M-R和KO间相当。与自体TILs共培养时，MEL01-B2M-R和KO细胞诱导的IFN-γ产生减少，MHC-I阻断显著降低IFN-γ产生，表明该TIL活化依赖MHC-I。加入重组人可溶性CD109未恢复与KO细胞共培养TILs的IFN-γ产生；流式细胞内IFN-γ染色显示与MEL01-B2M-R或KO共培养后产生IFN-γ的T细胞频率降低；钙黄绿素释放试验显示TILs对KO细胞的细胞毒性降低。526mel/MEL C6系统中，CD109敲除降低TILs对肿瘤细胞刺激的IFN-γ产生，MHC-I阻断显著降低该反应；CD109过表达在亲本526mel及KO背景中呈增加IFN-γ释放趋势，但未达统计学显著。
（4）黑色素瘤细胞CD109缺失通过在很大程度上不依赖TGF-β信号的机制损害TIL功能：MEL01 TILs的CD8⁺ T细胞组分表达TGF-β受体II；共培养实验中TILs单独不释放TGF-β，共培养时TGF-β释放量与肿瘤单独培养几乎不变，提示肿瘤细胞为主要TGF-β来源；MEL01-B2M与KO肿瘤细胞释放的TGF-β1量无差异。重组TGF-β1、TGF-β1中和抗体及TGF-β抑制剂SB431542在MEL01-B2M与KO细胞共培养中未显示基因型特异性IFN-γ产生差异，提示在该实验系统中CD109可能通过TGF-β中和以外机制增强TIL抗肿瘤活性。

讨论部分总结：讨论指出，ICIs虽延长黑色素瘤生存，但获益持久性不一；本研究聚焦CTLs杀伤肿瘤细胞这一中心事件及CTL内在特征、肿瘤内在特征和二者界面。B2M序列变异所致不可逆MHC-I丢失可完全废除T细胞免疫，MEL01即来自抗PD-1初始缓解后进展的病灶，后续治疗无效并发生全身转移；因此阐明并克服MHC-I保留时的识别后抵抗是关键挑战。CD109因临床样本分析及生物学机制被选中：CD109为GPI锚定细胞表面糖蛋白，在包括黑色素瘤的癌症中广泛表达，既往报道可通过 caveolar 途径及SMAD7/SMURF2依赖机制减弱TGF-β信号，可溶性形式可结合并隔离TGF-β配体。本研究中肿瘤细胞CD109较高与TILs活化及短期细胞毒性较强相关，且反应依赖MHC-I；可溶性CD109未恢复功能，提示膜结合CD109而非可溶性CD109支持TIL活化。初始TGF-β假说未获支持：TGF-β1产生在CD109完整与KO间相当，外源TGF-β1、中和抗体或SB431542均无基因型特异性差异；既往CD109介导TGF-β抑制多在肿瘤细胞自主模型报道，而本研究为自体黑色素瘤-TIL共培养，观察到的是CD109表达改变对肿瘤细胞及MHC-I依赖刺激下TIL变化的综合结果。讨论提出两种可能：本系统未检测到CD109对TGF-β的抑制作用，或存在不依赖TGF-β的替代机制。局限包括：抵抗亚系仅经两轮短期体外TIL共培养（每轮48小时）生成，不能排除体外选择影响；主要功能发现基于单个B2M改变相关MHC-I丢失患者的自体配对；回顾性多中心IHC队列组织获取异质、潜在未识别混杂因素及活检部位和时间变异；ROC cutoff基于当前数据集回顾确定，性能可能高估；Bonferroni校正后CD109表达与临床结局关联未达校正显著性阈值，临床发现需谨慎解释；样本量小可能降低统计效能。需进一步研究CD109下调在复杂肿瘤微环境中的意义及其作为ICI疗效预测生物标志物的价值。

研究结论翻译：本研究将CD109缺失鉴定为黑色素瘤中的识别后抵抗机制；CD109缺失在肿瘤细胞MHC-I表达保留的情况下减弱TIL活化和杀伤，且肿瘤细胞低CD109与ICI治疗后较差结局相关。此外，MHC-I重建和选择平台代表一种实用的体外筛选系统，具有揭示其他临床可处理的识别后抵抗机制的潜力。