PPP1R3G表达的上游功能性多态性调控及其在特应性皮炎风险与炎症中的作用

《JID Innovations》：Protein Phosphatase 1 Regulatory Subunit 3G Expression Mediated by Upstream Functional Polymorphisms Contributes to Atopic Dermatitis Risk and Inflammation

　　

蛋白磷酸酶1调节亚基3G（PPP1R3G）是受体相互作用蛋白激酶1介导的坏死性凋亡的调节因子，可能与特应性皮炎（AD）相关，但其参与机制尚未被探索。研究人员在Singapore/Malaysia Cross-Sectional Genetic Epidemiology Study（SMCGES）转录组队列（n=518）中，在高肿瘤坏死因子-α（TNF-α）条件下，比较了AD个体与非特应性、非AD对照者外周血单个核细胞（PBMC）中的PPP1R3G mRNA。研究人员分析了同一队列中PPP1R3G ±2-kb范围内的多态性与表达的关联，并在一个独立的SMCGES基因分型队列（n=2619）中评估了AD风险。研究人员使用荧光素酶报告基因实验和siRNA介导的PPP1R3G敲低研究了调控和下游效应。研究人员还评估了辅助性T细胞17（Th17）相关AD中的PPP1R3G表达。在TNF-α高条件下，AD患者的PPP1R3G表达较高（p<0.05）。rs6597110次要等位基因与较高的PPP1R3G表达（p<0.0001）和增加的AD风险相关（OR=1.55；95% CI：1.12–2.14；p<0.05）。rs6597110次要等位基因单倍型在TNF-α刺激的THP-1细胞中增加了PPP1R3G启动子活性（p<0.001）。研究人员证明PPP1R3G调控C-X-C基序趋化因子配体1（CXCL1）和C-X-C基序趋化因子配体2（CXCL2）的mRNA表达（p<0.01）。在Th17相关AD中PPP1R3G表达也较高（p<0.05）。上游变异可能增强TNF-α诱导的PPP1R3G表达和CXCL1/CXCL2介导的炎症，与Th17相关疾病亚型具有潜在相关性。

特应性皮炎（atopic dermatitis, AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，以瘙痒、反复湿疹样病变和皮肤干燥为主要特征，在新加坡儿童和成人中患病率分别约为20.6%和11.1%。慢性病程和频繁复发给患者带来显著的身心负担，并造成经济负担，因此加深对AD发病机制的理解十分必要。蛋白磷酸酶1调节亚基3G（protein phosphatase 1 regulatory subunit 3G, PPP1R3G）是蛋白磷酸酶1的调节亚基之一，参与细胞增殖、迁移、凋亡和坏死性凋亡等过程。已有研究显示，Ppp1r3g敲除小鼠血清细胞因子水平降低，并免受肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）诱导的系统性炎症反应。在TNF-α与肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1）结合后，含有受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1）的信号复合物组装，PPP1R3G被招募至该复合物，去磷酸化RIPK1上的多个抑制性残基，从而促进RIPK1激酶激活和坏死性凋亡。坏死性凋亡通过释放细胞因子和趋化因子参与AD发病，但PPP1R3G在AD中的作用尚未被直接研究。初步结果显示，在TNF-α高条件下，AD患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）中PPP1R3G表达较高，提示其可能参与AD发病。

研究人员利用新加坡/马来西亚横断面遗传流行病学研究（Singapore/Malaysia Cross-Sectional Genetic Epidemiology Study, SMCGES）的RNA测序和基因分型数据，对PPP1R3G在AD中的作用进行了整合转录组学和遗传学分析。结果显示，在TNF-α高条件下AD患者的PPP1R3G表达升高；rs6597110的次要等位基因与更高的PPP1R3G表达和增加的AD风险相关；该风险单倍型能在TNF-α刺激下增加PPP1R3G启动子活性；PPP1R3G可调控CXCL1和CXCL2表达；且在Th17相关AD中PPP1R3G表达较高。这些发现首次将PPP1R3G与AD发病联系起来，提示上游变异可能增强TNF-α诱导的PPP1R3G表达和CXCL1/CXCL2介导的炎症，对Th17相关疾病亚型具有潜在意义。

本研究使用了SMCGES队列中的转录组队列（518例中国人，来自新加坡国立大学和拉曼大学）和基因分型队列（2619例中国人，来自新加坡国立大学、拉曼大学和双威大学）。关键技术方法包括：RNA测序用于基因表达定量；基因分型、填补和质量控制后进行关联分析；顺式表达数量性状位点（cis-expression quantitative trait loci, cis-eQTL）分析评估SNP与PPP1R3G表达的关系；荧光素酶报告基因实验检测单倍型对启动子活性的影响；siRNA介导的PPP1R3G敲低结合逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）评估下游炎症因子表达；此外还使用ENCODE染色质状态、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和JASPAR转录因子基序预测等生物信息学工具进行功能注释。

在TNF-α高条件下，AD病例的PPP1R3G表达高于非特应性非AD对照。研究人员根据PBMC样本中内源性TNF-α转录表达的中位数，将样本分为高TNF-α组（≥中位数）和低TNF-α组（<中位数）。结果表明，在高TNF-α条件下，AD病例的PPP1R3G mRNA表达显著高于非特应性非AD对照（p<0.05），提示PPP1R3G可能响应炎症刺激而参与AD相关炎症。

rs6597110次要等位基因与更高的PPP1R3G表达和AD风险显著相关。在PPP1R3G基因上、下游各2-kb区域（chr6:5,083,575-5,091,721; GRCh37/hg19）内识别出12个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP），次要等位基因频率≥1%。连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）分析选择三个标签SNP（rs451476、rs200854、rs6597110）。cis-eQTL分析显示，rs200854和rs6597110的次要等位基因均与更高的PPP1R3G转录本表达显著相关（FDR和Bonferroni校正后p<0.0001），并在eQTLGen数据库（超过30,000个PBMC样本）和GTEx全血样本（n=670）中得到验证。在SMCGES基因分型队列中，经年龄和性别校正后，rs6597110的次要等位基因“C”与AD风险增加显著相关（OR=1.55；95% CI：1.12–2.14；p<0.05），而rs200854无显著关联。

单倍型3“ATACTCGTC”与AD风险升高和更高的PPP1R3G表达显著相关。LD分析显示rs6597110、rs113035141、rs147695851和rs1065500完全连锁（r²=1.00），代表同一遗传信号。功能注释未发现rs1065500影响microRNA（miRNA）结合位点；ENCODE ChIP-seq显示上游变异与K562、GM12878和GM12892等血/免疫相关细胞系的转录因子结合峰重叠，且该区域在K562和GM12878中与启动子相关染色质状态重叠。基于2-kb上游区域的9个SNP构建单倍型，单倍型3（频率=病例0.041 vs 对照0.028）与AD风险增加显著相关（OR=1.13；95% CI：1.06–1.21；p<0.05），而单倍型1和2无显著差异。荧光素酶报告实验显示，在TNF-α刺激的THP-1细胞中，单倍型3的荧光素酶活性显著高于单倍型1（p<0.001）和2（p<0.05），且仅单倍型3在TNF-α刺激下活性显著增加（p<0.01）。在PBMC高TNF-α条件下，单倍型3也与更高的PPP1R3G表达相关（vs 单倍型1 p<0.0001；vs 单倍型2 p<0.001）。

PPP1R3G调节CXCL1和CXCL2表达，两者在慢性AD中表达较高。在THP-1单核细胞系中，通过siRNA敲低PPP1R3G（mRNA表达降低约61.3%，p<0.0001）后，CXCL1（p<0.001）和CXCL2（p<0.01）的mRNA表达显著降低，而白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）水平无显著变化，表明PPP1R3G可能参与单核细胞中这些趋化因子的调节。此外，在SMCGES转录组队列中，慢性AD病例的CXCL1（p<0.05）和CXCL2（p<0.05）表达均显著高于非特应性非AD对照，提示这些趋化因子与慢性AD相关。

PPP1R3G在Th17相关AD中表达较高，可能参与Th17介导的炎症。由于CXCL1和CXCL2是白细胞介素-17（interleukin-17, IL-17）信号传导的下游靶标，研究人员以IL-17A mRNA表达作为Th17偏向炎症的生物标志物，将AD病例分为Th17相关AD和非Th17相关AD。结果显示，Th17相关AD病例的PPP1R3G表达显著高于非Th17相关AD（p<0.05）。在Gene Expression Omnibus（GEO）数据集GSE123088中（AD病例n=7，健康对照n=39），CD4+ T细胞中的PPP1R3G表达与IL-17A表达呈正相关（r=0.33；p<0.05）。这提示PPP1R3G可能参与Th17驱动的AD炎症。

讨论：本研究发现遗传调控的PPP1R3G表达升高与AD风险增加相关，且TNF-α依赖性启动子活性与ENCODE染色质状态数据一致。转录因子基序预测显示rs113035141可能影响ARNT::HIF1A和BHLHE40结合，这两种转录因子与炎症和Th17功能相关，但需要实验验证。rs6597110在GTEx皮肤组织中未显示显著eQTL作用，提示PPP1R3G介导的炎症可能不局限于皮肤，支持AD的系统性炎症特征。siRNA实验显示PPP1R3G调控CXCL1/CXCL2，而IL-6不变，可能与细胞类型或刺激条件差异有关。研究局限性包括RNA测序队列样本量较小、基因型分层分析受限，以及报告基因系统不能完全代表原代细胞。结论：上游变异可能增强TNF-α诱导的PPP1R3G表达和CXCL1/CXCL2介导的炎症，对Th17相关疾病亚型具有潜在意义。该研究通过整合遗传学、转录组学和功能验证，为理解PPP1R3G在AD发病中的贡献提供了基础。