《Pest Management Science》：Lack of fitness cost associated to CYP9K1-mediated insecticide resistance in Anopheles funestus, represents a threat to vector control
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抗性管理对于维持疟疾控制中杀虫剂的有效性至关重要，而理解代谢抗性的适合度代价是制定有效应急策略的关键。本研究调查了喀麦隆中部Anopheles funestus中两种关键代谢抗性机制CYP9K1（454A）和GSTe2（119F）相关的适合度代价。研究人员利用
抗性管理对于维持疟疾控制中杀虫剂的有效性至关重要，而理解代谢抗性的适合度代价是制定有效应急策略的关键。本研究调查了喀麦隆中部Anopheles funestus中两种关键代谢抗性机制CYP9K1（454A）和GSTe2（119F）相关的适合度代价。研究人员利用基于DNA的诊断工具评估了适合度参数，同时监测了抗性等位基因频率在世代间的变化。
研究结果揭示，454A-CYP9K1赋予适合度优势，具体表现为加速化蛹（RR对SS：OR=4.85；P<0.0001）和延长成蚊寿命（RR对SS：OR=4.91；P=0.0001）。相比之下，119F-GSTe2对蚊虫生命性状无显著影响。研究人员未观察到CYP9K1或GSTe2的表达与成蚊寿命、幼虫发育（P=0.2和P=0.1）或产卵等生命性状之间存在显著相关性。在无杀虫剂暴露条件下经过13代后，尽管纯合抗性454A/A-CYP9K1基因型消失，454A-CYP9K1抗性等位基因仍以中等频率（0.39–0.32）持续存在，表明敏感性恢复缓慢。相反，GSTe2的敏感性恢复较快，119F-GSTe2抗性等位基因从0.14下降至完全消失。
这些发现阐明了适合度代价如何影响杀虫剂抗性逆转。虽然去除杀虫剂压力可以促进敏感性恢复，但该过程对某些基因（CYP9K1）可能较慢，而对其他基因（GSTe2）则较快。此外，与抗性相关的媒介寿命延长可能增强疟疾传播潜力。? 2026作者。John Wiley & Sons Ltd代表化学工业学会出版《Pest Management Science》。
论文解读
研究背景与问题
疟疾仍是全球重大公共卫生挑战，2024年报告2.63亿病例和61万死亡。按蚊是疟疾传播的主要媒介，以杀虫剂处理蚊帐（ITNs）和室内滞留喷洒（IRS）为核心的杀虫剂干预是控制疟疾的关键工具，2000年至2015年间使疟疾死亡率降低了60%。然而，2015年后进展停滞，部分原因在于杀虫剂抗性的广泛出现。对拟除虫菊酯类杀虫剂的过度依赖造成了强烈的选择压力，促进了杀虫剂抗性的发展。在多种抗性机制中，代谢抗性尤为令人担忧，因其与防控失败密切相关，主要涉及细胞色素P450单加氧酶（CYP）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和酯酶三大酶家族。杀虫剂抗性基因通常被认为在无杀虫剂压力下会带来适合度代价，即对蚊虫生命性状产生负面影响，这一假设是杀虫剂轮换等抗性管理策略（IRM）的前提。然而，代谢抗性相关适合度代价的研究才刚刚起步，主要受限于此前缺乏基于DNA的分子标记。
研究目的
本研究聚焦于喀麦隆中部Anopheles funestus中两种关键代谢抗性机制——CYP9K1（454A）和GSTe2（119F）——的适合度代价。此前研究已鉴定出L119F-GSTe2和G454A-CYP9K1等抗性标记，但CYP9K1的适合度代价尚未被探索。值得注意的是，454A-CYP9K1等位基因从2014年在乌干达几乎固定（90%）到2020年在喀麦隆占主导（84.6%），显示出快速扩散能力。鉴于CYP6P9a/b抗性主要局限于南部非洲，亟需获取不同非洲地区P450抗性的适合度代价数据，以合理制定IRM策略。
主要技术方法
研究人员于2023年2月从喀麦隆Elende（3°28′0″N，11°43′0″E）采集野外An. funestus蚊虫作为抗性种群，并将Fang实验室敏感品系（自2002年起实验室饲养）与Elende野外蚊虫杂交建立（Fang × Elende）杂交品系，在无杀虫剂环境下维持13代以评估敏感性恢复动态。研究采用等位基因特异性PCR（AS-PCR）对G454A-CYP9K1和L119F-GSTe2两个抗性位点进行基因分型；利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测CYP9K1和GSTe2的表达水平；对CYP9K1基因进行PCR扩增和测序分析其遗传多样性。适合度参数评估涵盖雌蚊产卵力和生育力、幼虫存活、蛹形成和成蚊寿命等生命性状。
研究结果
3.1 CYP9K1和GSTe2抗性基因与雌蚊产卵力和生育力的关联
通过比较产卵与未产卵雌蚊的基因型分布、等位基因频率、产卵数和孵化率，研究人员发现CYP9K1和GSTe2两个位点在等位基因水平和基因表达水平上均未显著影响雌蚊产卵力或生育力。产卵雌蚊与未产卵雌蚊在G454A-CYP9K1位点的基因型分布（χ2=4.62；df=2；P=0.08）和等位基因频率（χ2=0.02；df=1；P=0.14）均无显著差异；L119F-GSTe2位点RR基因型与SS基因型之间的产卵OR不显著（OR=1.32；CI 95%：0.6–2.9；P=0.54）。两个位点的产卵数和孵化率在不同基因型及基因型组合间均无显著差异，基因表达水平也未达到差异表达阈值（FC=2）。
3.2 CYP9K1和GSTe2抗性基因与未成熟阶段发育的关联
通过比较L2和L4幼虫阶段的基因型频率，研究人员发现CYP9K1位点（χ2=18.84；df=2；P<0.0001）和GSTe2位点（χ2=7.13；df=2；P=0.03）的基因型分布均存在显著差异。杂合454A/G-RS个体从L2到L4的存活能力显著高于纯合抗性454A/A-RR（OR=3.46；CI 95%：1.6–7.1；P=0.002）和纯合敏感454G/G-SS个体（OR=4.47；CI 95%：2.2–9.3；P<0.0001），显示杂合优势。然而，RR与SS基因型之间的存活OR在CYP9K1（OR=0.77；CI 95%：0.4–1.5；P=0.49）和GSTe2（OR=1.43；CI 95%：0.6–3.2；P=0.5）位点均不显著，表明单个抗性等位基因不影响幼虫发育。双纯合抗性（RR/RR）个体从L2到L4的存活率显著低于RR/SS（OR=9.44；CI 95%：1.8–37.7；P=0.005），而双杂合（RS/RS）存活率显著高于RR/RR（OR=18.42；CI 95%：4.01–66.5；P<0.0001）。基因表达水平在L2和L4间无显著差异（CYP9K1：P=0.2；GSTe2：P=0.1）。
在蛹形成方面，化蛹发生在孵化后8天（dph）至17天后，峰值在11 dph。纯合抗性454A/A-RR蚊虫的蛹形成显著快于纯合敏感454G/G-SS（OR=4.85；CI 95%：2.5–9.1；P<0.0001）和杂合454A/G-RS（OR=7.93；CI 95%：2.8–21.5；P<0.0001）。454A-CYP9K1抗性等位基因在化蛹首日（8 dph）的频率显著高于末期（15–17 dph）（OR=4.02；CI 95%：2.2–7.1；P<0.0001），表明该等位基因与加速化蛹密切相关。L119F-GSTe2位点RR与SS之间的化蛹OR不显著（OR=1.13；CI 95%：0.4–2.8；P>0.99），但RR比RS化蛹更快（OR=5.59；CI 95%：2.9–10.7；P<0.0001）。双纯合抗性（RR/RR）蚊虫的化蛹显著快于所有其他基因型组合，包括SS/SS（OR=45；CI 95%：7.8–228.9；P<0.0001）、SS/RR（OR=8.33；CI 95%：2.3–26.5；P=0.001）和RS/RS（OR=32.5；CI 95%：7.3–134.1；P<0.0001）。
3.3 CYP9K1和GSTe2抗性基因与成蚊寿命的关联
通过比较第1天至第30天成蚊的基因型频率，研究人员发现CYP9K1位点的基因型分布从第1天到第20天（χ2=2.34；df=2；P=0.31）和第30天（χ2=0.378；df=2；P=0.84）均无显著变化。然而，纯合抗性454A/A-RR蚊虫在第10至20天之间的存活率显著高于纯合敏感454G/G-SS（OR=4.91；CI 95%：2.2–11.1；P=0.0001），454A-CYP9K1抗性等位基因在第20天的频率显著高于第10天（OR=2.5；CI 95%：1.4–4.3；P=0.003），表明该等位基因赋予成蚊寿命适度的适合度优势。L119F-GSTe2位点RR与SS之间的存活OR不显著（OR=2.32；CI 95%：0.6–7.2；P=0.2），等位基因频率比较也无显著差异（OR=1.31；CI 95%：0.7–2.3；P=0.5），表明119F-GSTe2不显著影响成蚊寿命。基因表达分析显示CYP9K1（P=0.2）和GSTe2（P=0.1）从第1天到第30天的表达水平无显著差异。
3.4 CYP9K1多态性与寿命的关联
对56个CYP9K1基因序列的分析揭示了42个多态位点和19个单倍型。单倍型多样性（hd）从第30天的0.67到第10天的0.89不等，单倍型数量从第1天的25个减少到第30天的7个，核苷酸多样性（π）从早期的0.002–0.003下降到第30天的0.0008。中性检验在第1天显示负的Tajima's D（D=?1.89）和Fu & Li's D（D=?2.79，P<0.05）。单倍型网络分析显示两个主要单倍型（G454-CYP9K1和454A-CYP9K1），抗性454A-CYP9K1单倍型在第20天（9/14，64.28%）和第30天（10/12，83.33%）样本中频率更高，而敏感G454-CYP9K1单倍型在第1天样本中频率更高（10/18，55.5%）。系统发育树分析同样显示抗性454A-CYP9K1优势分支含有更高频率的第20天和第30天样本。
3.5 无杀虫剂压力下敏感性恢复的评估
在无杀虫剂环境下维持13代的（Fang × Elende）杂交蚊虫中，研究人员观察到G454A-CYP9K1位点（χ2=193.4；df=12；P<0.0001）和L119F-GSTe2位点（χ2=144.6；df=12；P<0.0001）的基因型频率均发生显著变化。从第3代（F3）到第13代（F13），CYP9K1位点纯合抗性454A/A-RR基因型频率显著下降并在F13消失，但454A-CYP9K1抗性等位基因频率在F3和F13之间无显著变化（0.39–0.32；OR=1.74；CI 95%：0.96–3.09；P=0.2），这归因于杂合454A/G-RS基因型的持续高频率。相反，119F-GSTe2抗性等位基因频率显著下降并在F13完全消失（从0.14到0），表明该等位基因的敏感性恢复较快。基因型组合分析显示，双纯合抗性（RR/RR）过于罕见，RS/RS从F3到F7迅速下降（从0.29到0.05）并在F13消失，而SS/SS频率从F1到F13稳步上升（从0.21到0.36）。
讨论与结论
本研究揭示了CYP9K1和GSTe2抗性等位基因在An. funestus中的适合度效应具有显著差异。454A-CYP9K1等位基因赋予加速化蛹和延长成蚊寿命的适合度优势，且CYP9K1表达水平（FC=1.8–2.4）远低于CYP6P9a（FC=9.5–78）和CYP6P9b（FC=3.4–11.1），这可能解释了缺乏强适合度代价的原因。该等位基因在无杀虫剂环境下持续存在，表明一旦建立便难以从野外种群中消除，对杀虫剂轮换策略构成挑战。同时，抗性蚊虫寿命延长可能增加疟原虫发育和传播的潜力。相比之下，119F-GSTe2等位基因在无杀虫剂压力下迅速丧失，表明在GSTe2介导抗性为主的种群中，杀虫剂轮换策略可能仍然有效。
研究结论指出，适合度代价并非所有抗性机制所固有，而是取决于多种因素，包括蚊虫种群的遗传背景、涉及的代谢通路以及每个抗性等位基因的功能动态。454A-CYP9K1等位基因与加速化蛹和延长成蚊寿命的关联赋予适度但显著的适合度优势，这一双重效应阻碍了抗性管理，可能减缓无杀虫剂环境中敏感性的恢复，同时通过延长抗性蚊虫寿命增加疟疾传播潜力。相反，119F-GSTe2等位基因在无杀虫剂压力下的快速丧失表明，在GSTe2介导抗性为主的种群中，通过杀虫剂轮换进行抗性管理可能仍然有效。这些发现强调了将种群特异性适合度评估纳入抗性管理策略的重要性，根据当地蚊虫种群的遗传和生态背景定制干预措施，可能为保持媒介控制工具的有效性提供更可持续的方法。
