无间隙、单倍型定相大麻（Cannabis sativa）组装揭示多倍化后基因组重塑并细化大麻素合酶基因演化

《Plant Biotechnology Journal》：Gap-Free Cannabis sativa Assemblies Reveal Post-Polyploid Genome Remodelling and Refine the Evolution of Cannabinoid Synthase Genes

　　

尽管大麻素（cannabinoids）具有治疗重要性，但无间隙大麻（Cannabis）基因组的稀缺限制了对大麻素生物合成遗传与基因组基础及基因组演化的解析。在此，研究人员构建了两个单倍型定相（haplotype-phased）、无间隙、金标准组装，并利用其研究多倍化后基因组重塑并细化大麻素合酶（cannabinoid synthase）基因的演化历史。对这些无间隙组装的分析恢复了与核心真双子叶植物（core eudicots）共享的γ全基因组三倍化（WGT）信号，未提供大麻中存在额外谱系特异性全基因组复制（WGD）的证据。现存大麻基因组反映了γ衍生重复中一部分的长期保留与分歧，以及随后非WGD来源的基因重复和重复序列相关重塑，这些对现今基因组多样化有实质贡献。此外，系统发育基因组学（phylogenomic）、结构和共线性（syntenic）证据表明，早于大麻–葎草（Cannabis–Humulus）分化发生的前体重复产生了大麻中保留于7号和2号染色体的两个谱系。在大麻中，7号染色体谱系随后扩张并分化为功能性大麻素合酶基因，而葎草仅保留类似大麻2号染色体拷贝的谱系。这种不对称保留与多样化为大麻中大麻素生物合成的起源与特化提供了新见解。总之，这些结果为理解大麻多倍体历史、大麻素合酶基因演化和基因组多样化提供了高质量基因组框架。

研究背景与问题：大麻（Cannabis sativa）是具有纤维、种子油、蛋白和药用价值的多用途作物，大麻素如Δ⁹-四氢大麻酚（Δ⁹-THC）、大麻二酚（CBD）和大麻酚? 原文 cannabigerol（CBG）为大麻萜酚? 可中文“大麻萜酚（CBG）”具有药理意义。大麻素生物合成核心步骤涉及橄榄醇酸（OA）、大麻萜酚酸（CBGA）及大麻二酚酸合酶（CBDAS）、Δ⁹-四氢大麻酚酸合酶（THCAS）和大麻色烯酸合酶（CBCAS）。THCAS/CBDAS位于7号染色体（Chr7）重复丰富、低重组区，早期大麻组装多含缺口或参考引导scaffolding，且全球种质尤其是亚洲材料代表性不足。多倍化历史仍有争议：早期Ks/4DTv分析提示额外1—2次WGD，而泛基因组研究支持无额外WGD但受转座元件（TE）遮蔽影响；BBE-like（小檗碱桥酶样）合酶演化细节亦未明。为此，研究人员构建无间隙、单倍型定相组装，以重估多倍化并细化大麻素合酶演化。该研究发表于《Plant Biotechnology Journal》，为解析多倍体历史、合酶基因演化和基因组多样化提供高质量框架，并有助于育种与合成生物学应用。

关键方法：研究材料为单株雌性Golden Cannabis sativa（GCS）克隆，源自中国农业科学院麻类研究所（长沙）由地方栽培种杂交选育的CBDA优势工业大麻（约4% CBD、未检出THC）；克隆繁殖保证同一基因型。采用PacBio HiFi、PacBio CLR、BGI Hi-C、Iso-Seq、H3K4me3 ChIP-seq、亚硫酸氢盐测序及GCS开花期转录组，并纳入PK、JL、Cannbio-2、Finola公共转录组。以HiFiasm和purge_dups构建双单倍型骨架，用CLR图及图引导无锚读长填补（GGUR）补缺，Hi-C校正；以BUSCO、LAI、QV、Merqury和回贴率质控。比较分析用WGDI、Ks/4DTv、OrthoFinder/CAFE5、DupGen_finder、IQ-TREE、AU拓扑检验和Treerecs；LTR-RT用LTR_FINDER、LTRharvest、LTR_retriever和TEsorter；PAV用minigraph；表达用HISAT2/StringTie2/TPM并与EDTA TE注释整合。

研究结果：
2.1 无间隙组装与Golden Cannabis sativa单倍型注释：通过多平台测序和GGUR获得GCS_Hap1与GCS_Hap2，大小741.03 Mb和744.89 Mb，0 gap，contig N50约78.94/79.92 Mb，LAI 23.54/23.24，QV 58.33/59.37，BUSCO 99.40%/99.30%；分别注释27 365和27 776个基因，识别端粒重复及45S/5S rDNA。结论为获得高质量、互补性强的无间隙单倍型资源。
2.2 比较基因组学与染色体尺度基因组架构：通过多基因组比较、共线性和系统发育分析，GCS在连续性与完整性上居前；识别25 619个等位基因对和3 873个单倍型特异基因；共线性总体强但各染色体存在倒位/易位；Cannabis与Humulus japonicus为姐妹群，分化约17 MYA；重复序列占78.50%，重复基因以分散重复最多、WGD衍生较少。结论为高杂合与结构变异塑造基因组架构。
2.3 推定着丝粒区结构特征与多样化：联合基因密度、TE分布、5mC、H3K4me3、GC和测序深度推断着丝粒；CRM类TE富集，Gypsy在部分染色体着丝粒富集而Copia较低；着丝粒LTR插入较老且Gypsy早于Copia；着丝粒大小2—7 Mb，Chr8具近端粒着丝粒。结论为着丝粒结构及重复组成高度多样化。
2.4 共享古老全基因组三倍化与大麻基因组演化：
2.4.1 共享古老WGT证据：通过基因内共线性、Ks/4DTv及与Vitis vinifera、Buxus austro-yunnanensis比较，并作谱系速率校正，Cannabis与Vitis Ks峰约1.27、Buxus约0.79，Cannabis对Vitis呈约3:1共线深度；支持共享核心真双子叶γ WGT，未检出额外谱系特异WGD。
2.4.2 LTR-RT全基因组分布与动态：通过LTR-RT鉴定、分类、PCA和系统发育，完整LTR-RT中Gypsy约60%、Copia约40%，Tekay/Retand和Ale为主要谱系；不同组装间组成相似但Cs10例外；Gypsy分歧较高、Copia较低，讨论提示Gypsy较早增殖、Copia较近。结论为重复景观具谱系与组装差异。
2.4.3 重复基因全基因组模式与演化分歧：用DupGen_finder划分五类重复，分散重复最多、转座重复次之、WGD衍生最少；TD/PR的Ka/Ks较高而WGD衍生较保守，Ks高且Ka/Ks低指示古老纯化选择。结论为WGT后小规模重复及差异保留塑造现有基因库。
2.4.4 大麻素合酶基因的祖先起源与谱系特异性扩张：通过直系同源组、结构域分类、系统发育、AU拓扑检验及基因树—物种树 reconciliation，合酶OG仅见于Cannabis；相关子树26序列中24来自Cannabis、2来自Humulus；AU支持(H,C2),C7…拓扑，提示Cannabis–Humulus分化前发生前体复制，Humulus丢失一支，Cannabis Chr7支扩张并多拷贝假基因化，CBDAS与CBCAS位于Chr7不同位点。结论为Chr7局部扩张分化而非近期染色体间简单复制。
2.5 大麻素合酶基因的结构保守与功能分化：通过PAV、拷贝数、系统发育和序列比对，CBDAS、THCAS、CBCAS形成单系并与Chr2同源物分开；每个单倍型组装最多一个完整CBDAS或THCAS；鉴定CBDAS/THCAS分支特异残基，PAML未检出正选择而呈强纯化选择。结论为BBE-like祖先复制后经Chr7局部扩张与分歧实现功能分化。
2.6 大麻素通路基因的基因组组织与表达：通过共线定位、拷贝数、TE插入与转录组整合，通路基因分布各异，TE插入数与表达呈非线性；表达推断对参考组装敏感；CBDAS在GCS、Cannbio-2和Finola高表达，CBCAS表达较低，THCAS/CBCAS阵列未达开花期全局表达峰；GCS不宜可靠评估THCAS或Y-linked表达但可解析CBDA相关区。结论为合酶区表达分析需谨慎并依赖高质量、基因中心化注释。

讨论总结：讨论指出，早期基于含缺口组装的额外WGD推断可能受组装连续性和分析尺度影响；无间隙组装及区块级共线性仅支持共享γ WGT，年轻峰更可能是WGT后基因对水平信号。重复景观约79%，应理解为古老WGT片段化、后续小规模重复和重复介导重塑的共同结果，Gypsy与Copia具不同增殖时序。合酶表达估计对参考基因组高度敏感，Chr7相似序列跨映射及TE丰富串联阵列使图基PAV和表达推断需谨慎。合酶演化上，研究细化为Cannabis–Humulus分化前前体复制、Chr2保留祖先样拷贝、Chr7局部扩张并分化出CBDAS/THCAS/CBCAS。研究结论（译）：更广泛地，GGUR组装为将结构变异与大麻素表型联系起来以及解析通路调控提供了有用框架；未来整合无间隙参考与转录组、代谢组和功能数据的研究应有助于阐明基因组变异如何塑造大麻素生物合成，并可能促进育种和合成生物学应用；此处建立的分析框架也可能适用于其他高度杂合、重复丰富和化学多样的植物基因组。