台湾养殖石斑鱼（Epinephelus spp.）Tenacibaculum maritimum感染的首次报道

《Journal of Fish Diseases》：First Report of Tenacibaculum maritimum Infection in Grouper (Epinephelus spp.) Aquaculture in Taiwan

　　

2024年4月至2025年间，台湾南部和澎湖县的养殖石斑鱼（Epinephelus spp.）在冬春季节转换期发生了6起独立的溃疡性皮肤病暴发，水温范围为19°C至24°C。病鱼表现为鳃盖、体侧躯干和尾柄区域的广泛表皮糜烂和深层真皮溃疡。组织病理学显示显著的被皮结构破坏，其特征为上皮脱落、深层真皮坏死和密集的嗜碱性丝状细菌垫沿坏死皮下肌纤维浸润。湿片镜检和革兰染色病灶涂片在所有病例（n = 18）中均一致显示成片的长而细的革兰阴性杆菌。在以天然海水（盐度30‰–35‰）配制的海洋琼脂上回收了18株具有淡黄色、扁平、黏附、不规则边缘特征的代表性分离株。种特异性聚合酶链反应（PCR）和近全长16S rRNA基因测序（1505 bp；与模式菌株NCIMB 2154T的一致性>99.5%）确认病原为Tenacibaculum maritimum。生理学特征分析显示其盐度耐受窗口狭窄（30‰–45‰），与经典温带菌株的更宽范围（10‰–35‰）形成对比。本研究是台湾养殖石斑鱼中T. maritimum的首次确定性分离及分子/生理学特征描述，将其宿主谱和地理分布范围扩展至亚热带海水养殖区。

论文解读：台湾养殖石斑鱼Tenacibaculum maritimum感染的首次确证

一、研究背景与问题

水产物种集约化养殖中，细菌性疾病的暴发是制约产业可持续发展的关键因素之一。在海洋硬骨鱼养殖中，一类由黄杆菌科（Flavobacteriaceae）拟杆菌门（Bacteroidota）成员引起的疾病——tenacibaculosis，正逐渐成为新的威胁，其中最具代表性的病原体为Tenacibaculum maritimum。该菌呈细长革兰阴性杆状，最早于1970年代在日本养殖真鲷（Pagrus major）和黑头鲷（Acanthopagrus schlegelii）的暴发性死亡中被发现，后被经表型及分子分类学（16S rRNA、gyrB）鉴定归入Tenacibaculum属。T. maritimum的全球分布范围遍及北大西洋、地中海、北美、大洋洲及东亚，感染宿主涵盖多种海水硬骨鱼。其病症典型表现始于小面积脱色灶，进而发展为广泛的表皮糜烂、真皮坏死及深溃疡，常累及鳍条和鳃，重者陷入肌层引起肌坏死。该病原可造成养殖鱼的高死亡率、外部病变导致商品价值下降，并带来巨大的经济损失。

石斑鱼（Epinephelus spp.）是东南亚最具经济价值的养殖海水鱼类之一。台湾自1970年代开始石斑鱼养殖，现已形成高度专业化的产业，年产量约18,000–22,000吨，占出口总值的30%–40%，主要养殖区域集中于台湾南部沿海。为追求产量而提高放养密度可能导致水质恶化，病原滋生。在亚洲石斑鱼养殖中，溃疡性皮肤病以往多被归因于弧菌（Vibrio），尤其是V. harveyi；其致病性与毒力因子相关，可通过破损皮肤侵入并导致高死亡率。然而，2024年4月至2025年4月间，台湾南部和澎湖县多个石斑鱼养殖场暴发了持续性的严重皮肤溃疡，初始被当地兽医怀疑为V. harveyi感染。鉴于T. maritimum作为海洋硬骨鱼原发性溃疡病原的全球重要性，且东南亚历史上仅有初步的疑似记录，缺乏分子和病理学上的确证，研究人员怀疑其参与了这些病变，并对此开展了系统的病因学调查。

二、研究内容与意义

研究人员对2024–2025年在台湾高雄市（1场）、屏东县（2场）和澎湖县（3场）共6个养殖场发生的独立疾病暴发事件进行调查，采集了18尾患病濒死石斑鱼（12尾杂交石斑鱼E. fuscoguttatus × E. lanceolatus和6尾巨型石斑鱼E. lanceolatus），并从各场获取了无症状同塘对照鱼12尾用于基线比较。现场水温19.0°C–24.0°C，盐度30‰–35‰，发病率为10%–30%，累计死亡率为1%–10%。研究人员通过病理学、微生物学、分子生物学和系统发育学手段，首次在台湾养殖石斑鱼中明确分离并鉴定了T. maritimum，扩展了该病原的宿主谱和地理分布范围至亚热带海水养殖区。

三、主要技术方法

研究人员采用了多学科综合诊断方法：对病鱼进行大体病理检查，结合皮肤刮取物的直接湿片镜检和革兰染色；组织DNA提取后，采用种特异性PCR检测V. harveyi溶血素基因（vhh）以及两套T. maritimum 16S rRNA引物对（MAR1/MAR2、Mar1/Mar2），同时筛查T. soleae和T. dicentrarchi。分离培养使用天然海水配制的Difco 2216海洋琼脂，经纯化后对目标菌落进行温度、盐度耐受性试验和API 20NE生化鉴定；通过通用引物27F/1525R扩增近全长16S rRNA基因，克隆后测序并构建系统发育树。皮肤、鳃及内脏组织经10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋切片，行苏木精-伊红（H&E）染色观察病理变化。

四、研究结果

4.1 样本收集与临床症状特征

所有18尾病鱼均呈现严重溃疡性皮肤病变，主要表现为鳃盖、体侧躯干和尾柄区域的表皮糜烂、深真皮溃疡；晚期病例可见尾鳍完全坏死脱落。无症状对照组皮肤完整，无可见病灶。皮肤刮取物镜检在18尾病鱼中均观察到大量长度7–20 μm的长丝状革兰阴性杆菌，内部脏器直接印片未发现细菌。

4.2 种特异性PCR检测

皮肤病灶组织的PCR检测结果显示，所有18尾病鱼的样本均对V. harveyi溶血素基因（1257 bp）和T. maritimum 16S rRNA基因（1088 bp及400 bp）呈阳性，而T. soleae和T. dicentrarchi均为阴性。无症状对照组、所有健康石斑鱼的T. maritimum扩增均为阴性，但V. harveyi阳性。内脏器官均无细菌DNA扩增。

4.3 细菌分离、鉴定和系统发育重建

在天然海水配制的海洋琼脂上培养5天后，所有18尾病鱼样品均回收了目标菌落——淡黄色、扁平、强黏附且边缘不规则。菌落经纯化后，镜下可见革兰阴性短杆状逐渐伸长至长达30 μm的丝状体。生理学试验证实分离株可在15°C–30°C范围内生长，盐度耐受局限于30‰–45‰（仅天然海水条件，NaCl不支撑生长），并具备氧化酶阳性、明胶液化阳性、吲哚产生阳性，及硝酸盐还原、葡萄糖发酵、脲酶活性阴性等特征。近全长16S rRNA基因序列（1505 bp）与T. maritimum模式菌株NCIMB 2154T一致性达99.5%–99.8%，系统发育树显示分离株与全球T. maritimum参考菌株聚为单系群。

4.4 组织病理学

组织病理检查显示病鱼的被皮结构广泛破坏：复层鳞状上皮完全缺失，真皮致密胶原层被核碎裂碎片和致密的嗜碱性细菌垫取代；高倍镜下可见大量长丝状杆菌侵入坏死的上皮残留物，并穿过基底膜渗入真皮和皮下组织。在深溃疡处暴露的骨骼肌中，肌纤维发生透明变性和Zenker坏死，伴横纹消失和肌原纤维断裂，丝状细菌排列于退化肌纤维间。内部脏器（肝、脾、肾、鳃）未见显著病变或细菌。健康对照组皮肤和肌肉组织结构完整，无炎症或细菌。

五、讨论与结论

在讨论中，研究人员指出T. maritimum可破坏宿主被皮屏障并促进继发感染，在临床中常与弧菌混合出现。本研究中的组织病理学证实该菌可穿透真皮侵入深层骨骼肌，展示出较强的组织侵袭能力。野外初始诊断将病灶归因于V. harveyi，主要是由于常规培养基（血琼脂、TCBS）有利于弧菌快速生长而抑制或掩盖了T. maritimum；T. maritimum不能利用NaCl作为渗透介质，必须依赖天然海水中的二价阳离子（Mg²⁺和Ca²⁺），且生长缓慢，需3–5天培养，因此极易在常规检测中被漏检。野外菌株的盐度耐受范围（30‰–45‰）明显窄于日本和智利参考菌株（10‰–35‰），这与台湾沿海养殖场持续维持高海水盐度（30‰–35‰）密切相关，表明高盐环境可能是其暴发的关键驱动因素。同时，本研究中疫情发生于19°C–24°C，低于V. harveyi典型的高温致病条件，提示T. maritimum可能在冬春季节的低温期原发损害被皮，为弧菌等继发感染创造条件。T. maritimum仅在患病鱼中检出，而V. harveyi在健康鱼中同样存在，进一步支持其作为溃疡性病变主要病原的临床相关性，但仍需科赫法则验证。研究中提出了通过降低盐度至30‰以下或提高水温至25°C以上的非药物防控思路。

结论部分指出，本研究表明T. maritimum与台湾养殖石斑鱼在冬春季节转换期（19°C–24°C）发生的6起严重溃疡性皮肤病及死亡事件一致相关。生理学特征分析显示这些亚热带石斑鱼分离株具有狭窄的高盐度耐受窗口（30‰–45‰）。这些发现强调了将海水配制选择性培养方法和分子检测纳入常规水产疾病监测的必要性，为石斑鱼养殖中加强生物安全和针对性健康管理奠定了基础。