《RSC Pharmaceutics》：Localized delivery of melatonin via a thermosensitive F127 polymeric micellar hydrogel improves sperm quality in inflammation-associated infertilityOpen Access
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慢性炎症与氧化应激引起的睾丸及附睾微环境损伤所导致的男性不育仍是重大临床挑战，亟需能够恢复局部微环境并改善精子质量的局部治疗策略。研究人员制备了一种温敏性PEO-PPO-PEO（Pluronic? F127）胶束水凝胶，用于褪黑素的睾丸内局部递送，并在实验性自
慢性炎症与氧化应激引起的睾丸及附睾微环境损伤所导致的男性不育仍是重大临床挑战，亟需能够恢复局部微环境并改善精子质量的局部治疗策略。研究人员制备了一种温敏性PEO-PPO-PEO（Pluronic? F127）胶束水凝胶，用于褪黑素的睾丸内局部递送，并在实验性自身免疫性附睾睾丸炎（EAEO）大鼠模型中评价其治疗效果。褪黑素是一种强效抗氧化及抗炎分子，但其水溶性有限；将其载入F127聚合物胶束（PMs）后，其水溶性提高约14倍，并实现了接近零级动力学的持续释放曲线。经睾丸内给药后，与以生理盐水中最大可溶浓度给予游离褪黑素相比，载褪黑素PMs显著改善了关键精子参数，包括存活率、活力、形态和DNA完整性。尽管非剂量匹配的实验设计无法独立区分更高褪黑素剂量与制剂介导递送各自的贡献，但值得注意的是，这些改善并未伴随睾丸或附睾炎症的显著减轻，也未改变睾丸引流淋巴结内T淋巴细胞亚群，提示其治疗效应可能主要与局部保护精子有关，而非通过调节潜在自身免疫反应实现。采用吲哚菁绿标记PMs进行的生物分布研究表明，制剂在睾丸内持续滞留，并分布至附睾及睾丸引流淋巴结，支持其向目标生殖组织的有效局部递送。此外，荧光素标记的PMs可被精子内化。综上，这些发现表明，通过温敏聚合物平台实现褪黑素的局部纳米结构递送，可在慢性炎症条件下有效改善精子参数。尽管该平台未能实现生精再生，但代表了炎症相关男性不育中支持精子质量的潜在靶向策略。
论文解读：温敏F127胶束水凝胶局部递送褪黑素改善炎症相关不育症精子质量
一、研究背景与问题
男性因素在不育夫妇中约占半数，且全球育龄人群中男性不育患病率呈上升趋势。睾丸炎症是感染、内分泌干扰物暴露、创伤、遗传突变及隐睾、精索静脉曲张等病理状态下的常见表现，也存在于大多数特发性不育病例中。慢性炎症可产生过量活性氧和活性氮（RONS），引起睾丸微环境的氧化和硝化应激，导致精子膜脂质过氧化、活力与存活率下降以及DNA碎片化，其中线粒体对氧化损伤尤为敏感。尽管膳食补充剂、抗氧化剂及精子筛选技术可改善部分精子参数，但缺乏提高妊娠率或活产率的实质性证据。因此，亟需针对睾丸功能障碍起源的新型治疗策略。
褪黑素除调节昼夜节律外，还表现出强效抗氧化和抗炎活性，是缓解睾丸慢性炎症和氧化应激的潜在候选药物。然而，其水溶性差、体内半衰期短、生物利用度有限，限制了临床应用。PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物——Pluronic? F127因生物相容性好、可自组装及温敏特性，被广泛用作纳米载体。本研究旨在开发一种温敏性F127胶束水凝胶，实现褪黑素的睾丸内局部递送，并在实验性自身免疫性附睾睾丸炎（EAEO）大鼠模型中评价其治疗效果。
二、研究内容与结论
研究人员将褪黑素包载于F127（25% w/v）聚合物胶束（PMs）中，系统研究了其理化性质、体外释放动力学、体内生物分布及治疗效果。结果表明，褪黑素在F127胶束中的表观溶解度较其在生理盐水中的固有溶解度提高约14倍，并实现接近零级动力学的持续释放。在EAEO大鼠中，经睾丸内注射载褪黑素F127 PMs后，精子存活率、活力、形态及DNA完整性均显著改善，且恢复至接近正常水平；但精子浓度、睾丸和附睾炎症评分及睾丸引流淋巴结中T淋巴细胞亚群未见显著变化。生物分布实验显示，F127 PMs可在睾丸内持续滞留，并分布至附睾和睾丸引流淋巴结；荧光标记实验证实PMs可被生精小管腔室内生精细胞及精子头部和中段摄取。该研究为通过局部纳米递送褪黑素保护炎症环境下精子质量提供了概念验证。
三、主要关键技术方法
本研究采用的主要关键技术包括：（1）基于Pluronic? F127温敏溶胶-凝胶转变特性的胶束水凝胶制备技术，在4 ℃下呈可注射溶胶态，在生理温度下原位凝胶化；（2）动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）用于胶束粒径、分布及形态表征；（3）紫外-可见分光光度法测定褪黑素溶解度及体外释放动力学，并采用零级、一级和Higuchi模型拟合释放曲线；（4）吲哚菁绿（ICG）标记PMs的活体及离体光学成像用于生物分布研究；（5）荧光素标记PMs用于细胞定位和精子摄取分析；（6）EAEO大鼠模型的建立（采用睾丸匀浆加完全弗氏佐剂及百日咳杆菌免疫Wistar大鼠）。实验动物为成年雄性Wistar大鼠，来源为布宜诺斯艾利斯大学药学院生物饲养室。
四、研究结果
1. 褪黑素在F127胶束中的溶解度及理化表征：褪黑素载入F127（25% w/v）胶束后，其在生理盐水中的溶解度提高约14倍。DLS显示载药后胶束粒径和PDI略有增加，TEM观察到载药胶束结构均一性略降，但仍保持球形纳米结构。
2. 体外释放行为：载褪黑素F127水凝胶在37 ℃下12 h内呈现渐进、近线性释放曲线，零级模型拟合度最高（R2 = 0.9961）。褪黑素释放与F127水凝胶质量损失高度平行，提示凝胶溶解是释放行为的重要贡献因素。
3. 游离褪黑素治疗EAEO大鼠的效果：以生理盐水中最大可溶浓度（1.8 mg mL?1）进行睾丸内注射，10天后精子存活率、活力和浓度均未见显著恢复，睾丸损伤和炎症评分亦无改善。
4. 载褪黑素F127 PMs治疗EAEO大鼠的效果：睾丸内注射载褪黑素（25 mg mL?1）F127 PMs后，精子存活率恢复至正常水平（84.70% ± 1.80% vs 正常82.70% ± 1.20%），活力显著提高（78.20% ± 1.90% vs 正常77.00% ± 0.90%），DNA碎片化显著低于未载药F127处理组，但精子浓度无变化。
5. 精子形态学改善：载褪黑素F127 PMs治疗后，精子头部异常率从EAEO组的38% ± 2%降至10.4% ± 0.8%，尾部异常率从48% ± 2%降至17% ± 3%，均接近正常组水平。
6. 睾丸损伤与炎症评分：载褪黑素F127 PMs治疗组与未载药F127组相比，睾丸损伤评分和炎症评分均无显著差异，表明治疗未能减轻睾丸组织炎症损伤。
7. 引流淋巴结免疫细胞分析：流式细胞术检测显示，载褪黑素F127 PMs治疗组与未载药组之间，CD4?CD25?、CD8?CD25?活化T细胞及Foxp3?调节性T细胞百分比均无显著差异，说明褪黑素未明显改变自身免疫相关T细胞平衡。
8. 生物分布与滞留：ICG标记F127 PMs经睾丸内注射后，在睾丸内持续滞留至少13天，并分布至同侧附睾和睾丸引流淋巴结；游离ICG则无相应分布信号。
9. 细胞定位与精子摄取：荧光素标记F127 PMs在注射后8 h即可见于生精小管腔室内，被生精细胞摄取；离体实验中，PMs可被精子内化，主要积聚于头部和中段。
五、讨论与结论
讨论部分指出，游离褪黑素因水溶性差，在固定100 μL注射体积内无法达到足够局部剂量，而F127胶束通过疏水相互作用将褪黑素溶解度提高约14倍，克服了这一限制。但研究存在剂量不匹配的固有局限性，无法独立区分高剂量与缓释递送各自的贡献。精子数量未改善与持续存在的睾丸炎症和损伤一致，提示治疗并未阻断自身免疫性炎症反应，而是通过保护精子免受氧化应激损伤发挥效应。褪黑素可能通过直接清除自由基、增强抗氧化酶活性以及受体介导信号通路（如MT1/PKC、MT1/cAMP/PKA）调节精子功能。高浓度褪黑素还可能通过与轴丝微管蛋白非特异性相互作用促进精子活力。F127 PMs的纳米尺度特性有助于药物从注射部位向生精小管、附睾及区域淋巴结分布。与传统全身给药相比，本研究首次采用睾丸内局部递送褪黑素策略，为炎症相关男性不育提供了新思路。研究结论为：温敏F127胶束水凝胶实现了褪黑素的局部持续递送，显著改善EAEO大鼠精子活力、存活率、形态和DNA完整性，但未恢复精子浓度或缓解炎症；该平台作为改善炎症相关不育中精子质量的潜在靶向策略，仍需进一步研究其长期安全性和生育力结局。
