棕色脂肪细胞急性PLIN5缺失揭示其对线粒体稳态与耐寒性不可或缺的作用

《Journal of Biological Chemistry》：Acute loss of PLIN5 in brown adipocytes reveals its indispensable role in maintaining mitochondrial function and cold tolerance

　　

冷暴露诱导小鼠棕色脂肪组织（brown adipose tissue, BAT）发生适应性分子和线粒体重塑，以维持产热。研究人员先前表明，脂滴包被蛋白Perilipin 5（PLIN5）在冷暴露下于BAT中被强烈诱导，并促进产热基因表达、线粒体重塑和解偶联呼吸。然而，BAT特异性组成型PLIN5缺失虽损害线粒体功能，却不引起冷不耐受，提示存在生理性代偿，可能通过诱导白色脂肪组织（white adipose tissue, WAT）中的产热基因实现。为检验这一可能性，研究人员构建了多西环素诱导型BAT特异性PLIN5缺失小鼠。成年小鼠在冷暴露期间急性缺失PLIN5后，BAT产热基因表达、线粒体嵴密度和解偶联线粒体呼吸降低，并导致冷不耐受。与组成型PLIN5敲除小鼠不同，BAT中急性PLIN5缺失的小鼠未能在腹股沟WAT中启动代偿性产热反应。总之，这些发现表明PLIN5是棕色脂肪细胞线粒体稳态以及冷暴露期间适应性产热所必需的。值得注意的是，通过细胞分级分离和蛋白酶保护实验，研究人员观察到冷暴露期间BAT中PLIN5富集于线粒体外膜。研究人员还观察到，BAT中PLIN5缺失与脂滴和线粒体之间接触减少无关，从而提示PLIN5在适应性产热中的作用可能取决于其转位至线粒体外膜，且该目的与脂滴和线粒体之间接触的形成无关。

研究背景与科学问题：PLIN5是一种在心脏、氧化型骨骼肌、禁食肝和BAT等高氧化组织表达的脂滴蛋白。基础状态下，PLIN5位于脂滴表面和胞质；儿茶酚胺激活β-肾上腺素能-蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）通路后，小鼠PLIN5在丝氨酸155（S¹⁵⁵）位点磷酸化，并在脂滴和细胞核中发挥不同功能。在脂滴表面，PLIN5协调脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase, ATGL）激活，水解脂滴内甘油三酯；磷酸化PLIN5亦富集于细胞核，促进SIRT1–PGC-1α（sirtuin 1–peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α）基因程序，增强线粒体生物发生和功能；此外，PLIN5曾被提出与线粒体关联，形成脂滴与线粒体间的物理系链。研究人员此前发现，C57BL/6小鼠6 °C冷暴露后BAT中PLIN5蛋白和mRNA显著增加并于48 h达峰，30 °C热中性环境则抑制其表达；多西环素（doxycycline, Dox）诱导Plin5转基因使室温下PLIN5蛋白增加4—5倍，伴随线粒体嵴密度、线粒体DNA和呼吸能力增加，并改善急性冷耐受、慢性冷适应、系统糖耐量和胰岛素敏感性，减少高脂饮食诱导的肝脂肪变性及促进腹股沟WAT（inguinal WAT, iWAT）健康重塑。相反，Ucp1-Cre介导的BAT组成型PLIN5敲除导致室温下BAT线粒体功能障碍、冷暴露下线粒体畸形和嵴密度显著降低，但未出现冷或葡萄糖不耐受，可能由iWAT中米色化基因诱导和代偿性米色脂肪产热解释。由此，组成型敲除可能因iWAT米色化代偿而掩盖BAT PLIN5缺失的系统表型；因此，研究人员构建急性、Dox诱导型BAT特异性PLIN5缺失模型，以规避慢性代偿，并检验PLIN5在棕色脂肪细胞线粒体稳态和冷适应产热中的直接作用。研究显示，急性PLIN5缺失导致BAT产热基因表达、线粒体嵴密度和解偶联呼吸降低，并引起冷不耐受；与组成型敲除不同，急性模型未能启动iWAT代偿性产热反应。研究还首次在冷暴露小鼠BAT内源性纯线粒体中观察到PLIN5富集于线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM），且PLIN5缺失不减少脂滴—线粒体接触。其意义在于确立PLIN5为棕色脂肪细胞线粒体稳态和冷暴露适应性产热所必需，并提示其线粒体作用可能不依赖脂滴—线粒体接触形成。

关键技术与方法：研究人员采用C57BL/6J背景小鼠，将Plin5 loxp/loxp与Ucp1-rtTA、TRE-Cre杂交构建Dox诱导型BAT特异性PLIN5敲除（BiKOPLIN5）模型，以缺TRE-Cre同窝鼠为对照；在23 °C、30 °C或6 °C及含Dox饲料7或21天条件下评估。关键技术包括qPCR、Western blot、冷耐受与口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test, OGTT）、³H-三油酸甘油酯和¹⁴C-脱氧葡萄糖摄取、H&E与免疫荧光、透射电镜及脂滴—线粒体接触定量、纯化线粒体与蛋白酶K保护实验、Seahorse/NeoFox线粒体呼吸测定，以及由Patrick Seale惠赠的棕色脂肪细胞系siRNA和PKA抑制剂处理；动物实验经UTSWMC IACUC批准，无人类队列。

主要研究结果：（1）诱导型BAT特异性PLIN5敲除小鼠的构建与验证：通过Plin5 loxp/loxp、Ucp1-rtTA和TRE-Cre杂交获得BiKOPLIN5小鼠，对照缺TRE-Cre；Western blot显示6 °C及Dox 7天对照BAT PLIN5升高约4倍，BiKOPLIN5降低约80%，雌鼠类似；iWAT、肝和心无显著差异，23 °C Dox 7天未降低BAT或iWAT PLIN5。结论是获得冷暴露条件下BAT特异性高效诱导敲除模型。（2）诱导型BAT Plin5敲除降低BAT产热基因表达：qPCR显示6 °C 7天对照BAT Plin5 mRNA增加而BiKOPLIN5无显著变化，BiKOPLIN5 BAT中多数产热基因（Ucp1、Dio、Ppargc）显著低于对照，iWAT无差异；21天Dox后BAT Plin5在23 °C和6 °C均大幅降低，6 °C iWAT亦降低；BAT中Ucp1、Dio、Elov3和Ppargc降低，iWAT中仅Ppargc差异有统计学意义。结论是急性BAT PLIN5缺失损害BAT产热基因程序，7天时iWAT无明显代偿。（3）急性BAT PLIN5敲除导致冷不耐受但不导致葡萄糖不耐受：体重和摄食无差异；高脂饮食8周后6 °C+Dox 7天OGTT在雄、雌鼠均相似；冷耐受测试中雄鼠各时间点体温较低且8 h显著，雌鼠4、6、8 h显著，冷耐受期间体重下降较少。结论是急性缺失导致冷耐受降低而非糖耐量异常。（4）急性BAT Plin5敲除降低BAT组织脂肪酸摄取：联合口服³H-三油酸甘油酯和¹⁴C-葡萄糖后，BiKOPLIN5 BAT脂肪酸摄取降低，iWAT、性腺WAT（gonadal WAT, gWAT）、心和肝无显著差异；各组织葡萄糖摄取无差异；血浆³H-三油酸甘油酯清除降低，¹⁴C-葡萄糖无差异；非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acids, NEFA）和甘油三酯（triacylglycerol, TAG）轻度升高但不显著；BAT、肝和iWAT组织学无差异，BAT和肝重量及TAG含量无差异，iWAT两组均广泛棕色化且UCP1免疫荧光强度相似。结论是缺失降低BAT脂肪酸摄取而不影响葡萄糖摄取，iWAT棕色化不足以克服BAT缺失所致耐寒缺陷。（5）冷暴露小鼠棕色脂肪细胞中PLIN5定位于线粒体外膜：电镜显示BiKOPLIN5冷应激棕色脂肪细胞线粒体畸形、嵴丢失和肿胀；脂滴—线粒体接触百分比、接触面/线粒体周长及接触面/脂滴周长无变化。纯化线粒体加蛋白酶K实验中，PLIN5仅在6 °C 48 h冷暴露BAT纯线粒体中检测到，室温无；BKOPLIN5敲除阴性对照无线粒体PLIN5；蛋白酶K处理后PLIN5与OMM标志TOM20（translocase of outer mitochondrial membrane 20）消失，内膜标志TIM23（translocase of inner mitochondrial membrane 23）抵抗，支持OMM定位。棕色脂肪细胞系中异丙肾上腺素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX）刺激增加总细胞S¹⁵⁵磷酸化及线粒体PLIN5丰度，PKA抑制剂PKI阻止线粒体定位和S¹⁵⁵磷酸化增加；线粒体组分未检测到S¹⁵⁵磷酸化PLIN5，原文提示可能去磷酸化或低于检测限。结论是冷暴露促进PLIN5富集OMM，PKA磷酸化促进其线粒体定位，而PLIN5缺失不改变脂滴—线粒体接触。（6）BAT Plin5敲除损害线粒体呼吸：BiKOPLIN5小鼠BAT mtDNA呈下降趋势但未达显著；分离BAT线粒体呼吸测定显示，BiKOPLIN5线粒体在丙酮酸后氧消耗率（oxygen consumption rate, OCR）降低，FCCP（carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone）后最大解偶联呼吸显著降低；加入鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate, GDP）后OCR下降较对照缓和，提示UCP1介导的解偶联呼吸受损，类似GDP药理抑制UCP1。结论是急性PLIN5缺失损害BAT线粒体氧化和解偶联呼吸。

讨论总结与研究结论翻译：讨论指出，急性7天与慢性组成型BAT PLIN5缺失均导致冷诱导的线粒体损伤和功能障碍，但急性模型出现冷不耐受，而慢性模型因有足够时间发生iWAT产热重塑而维持耐寒。慢性敲除冷暴露时iWAT产热基因在两组均诱导，但敲除组更明显且仅该组达统计显著；敲除组iWAT Ucp1 mRNA较对照高2.9倍但差异未达显著，提示慢性BAT PLIN5缺失促进iWAT适应性产热重塑以代偿BAT功能受损；这与Pereira等报道的BAT特异性OPA1敲除引起线粒体功能障碍并伴WAT棕色化代偿相似。急、慢性模型比较体现诱导型基因敲除评估急慢性失功能的价值。关于线粒体定位，本研究首次在小鼠BAT内源性纯线粒体中证明冷暴露时PLIN5富集于OMM。既往Carole Sztalryd等、Sarah Cohen等、Guenter Haemmerle等、Orian Shirihai等、Carles Cantó等和Pingsheng Liu等的工作分别涉及PLIN5线粒体定位、其C端与脂肪酸转运蛋白4（fatty acid transport protein 4, FATP4）互作、PKA调控、脂滴—线粒体接触、PLIN1（Perilipin 1）—Mfn2（mitofusin 2）系链及脂滴蛋白组学。与过表达模型不同，组成型和诱导型BAT PLIN5缺失均未见脂滴—线粒体接触差异，提示BAT中PLIN5并非基础脂滴—线粒体系链所必需，该功能可能由PLIN1或其他蛋白承担；亦不能排除胞质池PLIN5而非脂滴结合PLIN5转位至OMM发挥作用。PLIN5在BAT线粒体中的确切功能尚待定义，原文提出冷暴露时PLIN5可能与OMM蛋白互作，以在脂肪酸通量增加和β-肾上腺素能信号增强的代谢应激下帮助维持线粒体膜完整性；心肌细胞中全长PLIN5与氧化磷酸化和线粒体动力学复合物互作，但BAT线粒体特化于产热，机制可能不同，需未来研究。研究结论翻译：综上所述，结合研究人员先前发现PLIN5经PKA磷酸化后转位至细胞核以激活SIRT1–PGC-1α通路，这些数据确立PLIN5是脂滴功能与产热基因程序及线粒体功能之间的关键整合因子。虽然心脏、肝脏和肌肉研究已显示PLIN5协调脂肪酸处理与氧化代谢，本研究通过证明PLIN5在肾上腺素能刺激下富集于线粒体且在冷暴露期间为维持线粒体结构和呼吸所必需，将这一概念扩展至BAT。BAT中的这一线粒体作用不同于先前提出的PLIN5在其他组织中促进脂滴—线粒体接触的功能。相反，研究人员的发现支持一个模型：PLIN5将脂质动员与核转录反应及线粒体性能偶联，以满足产热的能量需求。