《Journal of Biological Chemistry》：Circular RNA circINSR regulates bovine intramuscular adipocyte development and lipid accumulation through insulin receptor signaling
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摘要：肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）以大理石纹形式沉积于牛肉中，是牛生产中肉质的关键经济指标。一系列环状RNA（circular RNA，circRNA）已成为脂质生成的重要调控因子。在本研究中，研究人员在犊牛与成年牛之间鉴定出373个
摘要：肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）以大理石纹形式沉积于牛肉中，是牛生产中肉质的关键经济指标。一系列环状RNA（circular RNA，circRNA）已成为脂质生成的重要调控因子。在本研究中，研究人员在犊牛与成年牛之间鉴定出373个差异表达的circRNA，其中circINSR在成年牛中显著上调。单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）分析揭示了肌内脂肪细胞的发育轨迹，证明前脂肪细胞可分化为白色和米色脂肪细胞。沿前脂肪细胞向白色脂肪细胞分化轴，133个基因在白色脂肪细胞中显著上调，并显著富集于胰岛素受体（insulin receptor，INSR）介导的PI3K-Akt信号通路。体外和体内功能研究证实，circINSR通过PI3K-Akt信号促进脂肪细胞分化，促进脂肪酸转运和合成，增强甘油三酯（triglyceride，TG）积累，并驱动脂滴成熟。机制上，circINSR作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA），通过螯合miR-712-5p上调INSR表达并增强脂质生成。研究结果阐明了牛背最长肌肌内脂肪细胞的细胞异质性和分化程序，并确立circINSR作为协调脂质生成的miR-712-5p海绵。这些发现推进了对优质肉牛IMF沉积分子机制的理解。
Xiao He等围绕牛肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）沉积的分子调控开展研究。IMF以大理石纹形式沉积于牛肉，是肉质的关键经济指标，影响嫩度、多汁性和风味；成年牛IMF通常高于犊牛，年龄是重要影响因素。IMF形成受多条通路、转录因子和非编码RNA协同调控。环状RNA（circular RNA，circRNA）稳定性高、保守且具组织特异性，可作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）吸附miRNA并上调靶基因；但牛等反刍动物中circRNA调控IMF脂质生成的机制仍相对不足。为此，研究人员比较新生犊牛与成年牛背最长肌circRNA转录组，并结合单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）解析肌内脂肪细胞异质性和分化轨迹，验证成年富集circINSR的功能与机制。研究得出circINSR通过miR-712-5p/INSR轴激活PI3K-Akt（phosphatidylinositol 3-kinase-Akt，磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B）信号，促进脂肪细胞分化、脂肪酸转运与合成、甘油三酯（triglyceride，TG）积累和脂滴成熟，从而调控牛IMF沉积；这为优质肉牛IMF沉积机制提供了新认识。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员整合NCBI SRA来源的15个牛背最长肌转录组数据集（新生Angus犊牛、24月龄Angus成年牛、18月龄山东黑牛、30月龄新疆褐牛和哈萨克牛各3头），用五种算法取交集鉴定circRNA，edgeR进行差异分析，PCR和Sanger测序验证头尾剪接。对广东梅州农场3头新生纯种Angus犊牛和3头24月龄Angus成年牛背最长肌进行snRNA-seq，经Cell Ranger、Seurat聚类及Monocle2拟时分析，并行GO（Gene Ontology，基因本体）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）富集。体外采用3T3-L1脂肪细胞过表达/敲低、油红O、TG测定、RT-qPCR（reverse transcription quantitative PCR，逆转录定量PCR）、Western blot和双荧光素酶报告；体内用6周龄C57BL/6小鼠尾静脉注射慢病毒构建过表达/敲低模型。统计采用Student’s t-test。
研究结果：1）Identification of circRNA candidates in bovine longissimus dorsi muscle：研究人员从NCBI SRA获得15个牛背最长肌转录组数据集，五种算法分别得到候选，仅5,833个被全部算法一致检测；主成分分析（principal component analysis，PCA）显示犊牛与成年牛circRNA组成明显分离；成年牛相对犊牛鉴定373个差异circRNA（334上调、39下调），66个达FDR（false discovery rate，错误发现率）<0.001；PCR和Sanger测序确认21个候选存在头尾剪接。2）Characterization of circINSR candidate：circINSR来源于INSR基因外显子2，成熟长度552-nt（nucleotide，核苷酸），与人hsa_circ_08489匹配；在3T3-L1细胞中经RT-PCR和Sanger测序确认，cDNA可扩增而gDNA不能，具RNase R抗性，放线菌素D处理后半衰期>24 h（线性INSR约6 h），主要定位胞质；结论为circINSR稳定内源表达并跨物种保守。3）Single-cell atlas of bovine longissimus dorsi tissues：对Angus犊牛和成年牛背最长肌snRNA-seq，质控后分别得11,520和7,943个细胞，鉴定14个细胞群，包括肌源性祖细胞、卫星细胞、肌细胞、肌纤维、胚胎肌纤维、前脂肪细胞、脂肪细胞、纤维脂肪生成前体细胞（fibroadipogenic precursors，FAPs）、内皮细胞、红细胞、腱细胞、周细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等；犊牛有76个前脂肪细胞无成熟脂肪细胞，成年牛有555个前脂肪细胞和72个成熟脂肪细胞；重聚类631个前脂肪细胞和72个脂肪细胞为progenitor、beige、white三个亚群，标记分别为PDE1C、PPARGC1A、APOA1/FABP4；白色脂肪细胞上调基因富集PPAR信号、脂肪酸延伸/降解、甘油酯和甘油磷脂代谢，米色脂肪细胞富集产热和三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）；拟时分析显示祖细胞分叉为白色和米色路径，沿白色分化轴的133个基因富集PI3K-Akt通路，INSR在白脂肪高表达并随分化升高。4）Role of circINSR in lipogenesis in vitro：构建OE-circINSR及两个si-circINSR；3T3-L1中过表达circINSR增加脂滴和TG，上调PPARγ、CEBPα、FAT1、FABP5、FASN、FADS1、DGAT1/2、MGAT1、PLIN1/3及相应蛋白，并增加INSR、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt；敲低呈相反变化；结论circINSR经PI3K/Akt促进脂质生成。5）Investigation of circINSR in Lipogenesis in vivo：用慢病毒LV-OE-circINSR和LV-sh-circINSR，6周龄C57BL/6小鼠尾静脉注射（第0、7、14、21天），4周后取血清、肝和腓肠肌；过表达增加腓肠肌和肝脂滴及血清TG，上调分化、脂肪酸转运/合成、TG合成和脂滴成熟相关基因及蛋白，激活INSR/PI3K/Akt；敲低则抑制；结论体内circINSR促脂质生成并激活PI3K/Akt。6）circINSR sponges miR-712-5p to boost INSR axis activity and drive lipidogenesis：预测到4个可同时靶向鼠和牛circINSR及INSR的miRNA，包括miR-712-5p、miR-6985-5p、miR-7053-5p和miR-7018-5p；双荧光素酶报告显示miR-712-5p降低circINSR-WT和INSR 3
′UTR-WT活性，对突变体无此作用；miR-712-5p mimic下调INSR及PPARγ、C/EBPα、FABP5、FASN蛋白，inhibitor上调PPARγ、CD36、FASN及INSR；rescue实验中OE-circINSR+mimic逆转促脂作用，si-circINSR+inhibitor挽救抑制；结论circINSR作为miR-712-5p海绵上调INSR。
讨论部分总结：作者总结circRNA在多种物种脂肪代谢中的作用，牛脂肪组织已有circBDP1、circPPARγ等报道；circINSR与hsa_circ_08489同源，成年牛高表达；既往在人心肌、禽胸肌、牛胚胎和羊基质血管组分（stromal vascular fraction，SVF）中报道不同功能，作者从细胞类型与模型、ceRNA网络和发育阶段解释与本研究相反结果。snRNA-seq可解析bulk测序掩盖的异质性和稀有前脂肪细胞；白色脂肪细胞主要储存TG；INSR为代谢调节因子，猪中INSR表达与IMF和年龄相关；ceRNA机制中circINSR吸附miR-712-5p。研究结论翻译：总之，本研究表明circINSR在体外和体内调控肌内脂肪代谢中的关键作用。机制上，circINSR通过circINSR/miR-712-5p/INSR轴促进脂质生成，启动下游PI3K-Akt信号通路激活。这些发现加深了对牛IMF沉积分子机制的理解。
