MCUb亚基基质结构域Ser77磷酸化锁定构象抑制线粒体钙离子通道通量

《Journal of Biological Chemistry》：Phosphorylation of the mitochondrial calcium uniporter beta subunit matrix domain locks a conformation that suppresses mitochondrial calcium flux

　　

线粒体钙离子（Ca2+）摄取是代谢、信号转导和细胞死亡通路的核心调控环节。线粒体钙离子单向转运体复合物（mitochondrial calcium uniporter complex, mtCU）通过由MCU和MCU beta（MCUb）亚基构成的四聚体孔道介导这一通量。两个旁系同源蛋白的大型、朝向基质侧的氨基（N）-末端结构域（N-terminal domains, NTDs）是关键调控枢纽，对离子结合和翻译后修饰均有响应。尽管MCU与MCUb的NTD序列同一性高，但研究人员此前发现二者在调控性离子结合机制上存在显著差异。此外，虽然已知蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）对MCU-NTD Ser92位点的磷酸化可诱导构象变化进而调节mtCU通量，但MCUb上保守的翻译后修饰位点是否发挥相似或不同的调控作用仍未阐明。本研究利用比色法磷酸释放与磷蛋白染色实验、溶液核磁共振波谱（solution NMR spectroscopy）以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），揭示PKCδ可磷酸化MCUb-NTD的Ser77位点。此外，S77D磷酸模拟突变体展现出与磷酸化状态一致的结构与分子动力学行为。值得注意的是，单独引入S77D替换便足以驱动MCUb-NTD进入类似于Ca2+结合态的构象（在计算机模拟与体外实验中均如此），从而绕过离子结合的需求。这种磷酸化诱导的构象转变表现出热稳定性增强，但与MCU-NTD的异源寡聚化能力相较于野生型有所减弱。功能上，MCUb-S77D在HEK293T和HeLa细胞中降低了线粒体Ca2+摄取，且未改变其与MCU的共定位。综上，研究结果表明Ser77磷酸化将MCUb-NTD锁定为一种对Ca2+不敏感、模拟Ca2+结合态的构象，从而增强了其对线粒体Ca2+通量的抑制作用。

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研究背景与科学问题

线粒体钙离子（Ca²⁺）摄取是调控细胞能量代谢、信号转导和凋亡的关键过程，主要由位于线粒体内膜上的线粒体钙离子单向转运体复合物（mitochondrial calcium uniporter complex, mtCU）介导。mtCU的核心孔道由MCU和其显性负调控亚基MCUb组装成的四聚体构成。这两个亚基面向基质侧的大段氨基末端结构域（N-terminal domains, NTDs）是重要的调控中心，既能结合二价阳离子，也能发生磷酸化等翻译后修饰。已有研究表明，蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）对MCU-NTD第92位丝氨酸（Ser92）的磷酸化会诱导构象变化，进而调节mtCU的通量。然而，MCUb上与Ser92高度保守的Ser77位点是否也受到类似的磷酸化调控，以及这种修饰对mtCU功能的特异性影响，此前尚不清楚。鉴于MCU和MCUb的NTD在离子结合机制上存在差异，本研究旨在系统探究MCUb-Ser77磷酸化的结构、动力学和功能后果，以揭示这两个旁系同源蛋白在调控机制上的进一步分化。

研究内容与结论

研究人员首先通过一系列生化与生物物理实验证实了MCUb-Ser77是PKCδ的磷酸化靶点。随后，利用分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟、圆二色光谱（circular dichroism, CD）、尺寸排阻色谱联用多角度光散射（size exclusion chromatography with in-line multi-angle light scattering, SEC-MALS）、内源荧光光谱、外源8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-napthalene sulfonate, ANS）结合实验以及溶液核磁共振波谱（solution NMR spectroscopy）等技术，深入研究了S77D磷酸模拟突变对MCUb-NTD结构、稳定性、相互作用及钙离子敏感性的影响。最终，在HEK293T和HeLa细胞模型中评估了该突变对线粒体钙离子摄取的调控功能。

主要技术方法

1. 1.
   体外激酶活性检测：采用BIOMOL Green磷酸释放法和Pro-Q Diamond磷蛋白染色法验证PKCδ对MCUb-NTD的磷酸化。
2. 2.
   质谱鉴定：使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）精确定位磷酸化位点为Ser77，并在人心脏衰竭临床样本（包括射血分数保留型和降低型心衰患者）的公开蛋白质组学数据（PRIDE数据库编号PXD060431）中进行靶向检索验证。
3. 3.
   计算模拟：进行全原子分子动力学（MD）模拟（1微秒时长），比较野生型（wild-type, WT）、磷酸化模拟（S77D和S92D）及真实磷酸化（S77p2和S92p2）状态下MCU与MCUb NTD的结构动态。
4. 4.
   生物物理表征：运用远紫外圆二色（far-UV CD）光谱和内在荧光监测热稳定性；通过SEC-MALS和基于MCU-NTD_F111W突变体的内源荧光滴定测定异源二聚化的亲和力；利用ANS外源荧光探测钙离子诱导的疏水表面暴露变化。
5. 5.
   核磁共振波谱：采集¹H-¹⁵N HSQC谱，分析MCUb-NTD磷酸化或突变引起的化学位移扰动（chemical shift perturbations, CSPs），以及这些扰动对MCU-NTD-MCUb-NTD相互作用的直接影响。

研究结果

1. Ser77是MCUb上一个保守的PKCδ磷酸化位点

体外激酶实验和LC-MS/MS分析确认PKCδ可直接磷酸化MCUb-NTD的Ser77残基。在人类心衰组织的蛋白质组学数据中同样检测到该位点的磷酸化肽段，表明其在病理生理条件下真实存在。

2. S77D突变体与S77p2在结构和动力学上表现相似

长达1微秒的MD模拟显示，无论是S77D还是S77p2，均破坏了MCUb-NTD中Ser77与Asp104之间的瞬时氢键，导致包含Ser77的loop 2（L2）区域波动性（root mean square fluctuation, RMSF）降低，与MCU-NTD中S92D/S92p2的效果一致，验证了S77D作为可靠磷酸模拟物的有效性。

3. S77D增强MCUb-NTD的热稳定性但不改变二级结构

远紫外CD光谱表明，MCUb-NTD_WT和MCUb-NTD_S77D的二级结构组成无差异。然而，热变性实验显示，S77D突变使第二个相变中点温度（T_m,2）显著提高约9-10°C，表明该突变赋予了整体折叠更高的热稳定性。

4. S77D削弱了MCUb-NTD与MCU-NTD的异源二聚化亲和力

SEC-MALS实验显示，MCU-NTD与MCUb-NTD_S77D混合后，异源二聚体的形成效率低于与MCUb-NTD_WT的混合。内源荧光滴定定量测定进一步证实，MCUb-NTD_S77D与MCU-NTD_F111W的结合常数（K_d = 1.36 μM）约为野生型（K_d = 0.45 μM）的3倍，亲和力显著降低。

5. MCUb-NTD_S77D减弱了对MCU-NTD结构的扰动效应

溶液NMR实验表明，与MCUb-NTD_WT相比，MCUb-NTD_S77D与¹⁵N标记的MCU-NTD结合后，引起的化学位移扰动（CSPs）幅度更小，尤其在MCU调控性酸性斑块（MCU regulating acidic patch, MRAP）区域，表明S77D突变削弱了MCUb-NTD诱导MCU-NTD构象重排的能力。

6. S77D消除了MCUb-NTD对Ca²⁺的敏感性

ANS荧光实验显示，加入Ca²⁺后，MCUb-NTD_WT的疏水表面暴露增加，而MCUb-NTD_S77D则无此变化。MD模拟进一步揭示，S77D和S77p2均大幅减少了Ca²⁺与MCUb上优先/调控性结合位点（如D99和E103）的接触，表明磷酸化使MCUb-NTD对Ca²⁺刺激变得不敏感。

7. Ser77磷酸化将MCUb-NTD锁定为Ca²⁺结合态样构象

MD轨迹对比分析表明，无论是否存在Ca²⁺，MCUb-NTD_S77D和MCUb-NTD_S77p2的构象始终更接近于Ca²⁺结合态的野生型MCUb-NTD，而非其脱钙状态。溶液NMR数据亦支持这一观点，显示S77D突变体与Ca²⁺饱和的野生型蛋白具有相似的化学位移特征，且PKCδ处理后的野生型蛋白也呈现出向S77D构象迁移的趋势。

8. MCUb-S77D在细胞水平上增强了对线粒体Ca²⁺摄取的抑制

在透化处理的HEK293T细胞和完整的HeLa细胞中，表达MCUb-S77D突变体均导致线粒体Ca²⁺摄取速率和总量显著低于表达野生型MCUb的细胞，而其与MCU的共定位并未改变。这表明Ser77磷酸化通过锁定MCUb-NTD的特定构象并削弱其与MCU-NTD的互作，强化了MCUb对mtCU活性的抑制功能。

总结与讨论

本研究的核心发现是揭示了MCUb亚基Ser77位点的磷酸化是一种关键的翻译后修饰，它通过将MCUb的氨基端结构域（NTD）锁定在一个类似Ca²⁺结合态的刚性构象中，使其丧失对基质Ca²⁺浓度变化的响应能力。这种构象锁定虽然增强了MCUb-NTD自身的热稳定性，但却削弱了它与MCU-NTD形成高效异源二聚体的能力，最终在细胞层面表现为对线粒体Ca²⁺摄取的更强抑制。

研究人员得出结论：PKCδ介导的MCUb-Ser77磷酸化通过“锁定”其NTD构象并解除其与Ca²⁺结合的偶联，放大了MCUb对mtCU通道的抑制效果。这与之前报道的MCU-Ser92磷酸化可能通过不同机制调控通道活性的发现形成对比，定义了两个旁系同源蛋白在磷酸化依赖性调控上的一个关键分歧。该研究为理解mtCU在生理及病理条件下的复杂调控网络提供了新的分子机制，并指出MCUb-Ser77的磷酸化状态可能是影响心脏等应激组织中线粒体钙稳态的重要决定因素。