CD34+祖细胞免疫表型分析在骨髓增生异常肿瘤中的临床应用——CytHem SMD法国协作网络经验

《Cytometry Part B: Clinical Cytometry》：Clinical applications of CD34+ progenitor cell immunophenotyping in myelodysplastic neoplasms—The CytHem SMD French network experience

骨髓增生异常肿瘤（MDS）是一类克隆性造血疾病，以无效造血、外周血细胞减少及向急性髓系白血病（AML）进展的风险为特征。由于疾病起源于造血干/祖细胞（HSPCs），流式细胞术（FCM）已成为解析骨髓CD34⁺细胞区室的关键方法，为形态学、细胞遗传学和分子学研究提供补充信息。本综述总结MDS中CD34⁺细胞改变的最新知识，围绕三个主要方面组织：数量异常、免疫表型异常及祖细胞结构破坏。基于这些互补性异常，法国CytHem-SMD工作组开发了一种整合性流式细胞术策略，将既有诊断评分与白血病干细胞及祖细胞结构分析相结合。研究人员介绍该方法及在不同实验室标准化实施的持续工作，并讨论未来发展方向，预期进一步提高MDS中CD34⁺区室评估的可重复性和临床效用。

1 引言（INTRODUCTION）

骨髓增生异常肿瘤（MDS）是一组异质性疾病，主要影响老年患者，以无效造血导致的血细胞减少及向急性髓系白血病（AML）进展风险增加为特征。MDS诊断仍以骨髓（BM）和外周血涂片形态学检查为初始评估基础，病态造血及原始细胞比例对分类具有关键意义，细胞遗传学、突变分析和免疫表型评估常用于疾病完整表征。世界卫生组织（WHO）分类识别出具有定义性遗传异常的MDS（如双等位TP53失活、MDS-5q、MDS-SF3B1）及形态学定义的MDS（如低原始细胞MDS-LB、原始细胞增多MDS-IB1/IB2、伴纤维化MDS、低增生MDS）。国际预后评分系统（IPSS-R、IPSS-M）可评估进展风险。病理生理上，疾病起源于造血干/祖细胞（HSPCs），其获得RNA剪接、表观遗传调控、转录和细胞内信号等通路相关基因的体细胞突变，形成克隆扩增及骨髓祖细胞区室重塑；随附加遗传损伤累积，克隆结构复杂化，异常祖细胞群体出现并损害正常造血分化，约20%–30%患者进展为AML。因致病改变主要累及未成熟造血细胞，骨髓祖细胞区室尤其是CD34⁺ HSPCs的详细表征成为研究疾病生物学及改善诊断和预后评估的重要途径。流式细胞术（FCM）可分析CD34⁺区室的数量和定性异常，已被推荐与骨髓形态学联合用于检测髓系细胞表型病态造血。法国CytHem-SMD工作组于2020年成立，旨在分享标准化FCM检测在常规实验室实施的经验并提供数据解读建议；CD34⁺ HSPCs区室分析是该策略的核心组成部分。本综述概述MDS中CD34⁺ HSPCs表型异常，分为数量异常、免疫表型异常及CD34⁺区室内分布改变，并讨论其整合入常规FCM流程用于诊断、预后分层和诊疗决策。

2 CD34⁺髓系祖细胞的数量异常（QUANTITATIVE ABNORMALITIES OF CD34⁺ MYELOID PROGENITORS）

在MDS中评估CD34⁺髓系HSPCs（myCD34⁺ HSPCs）时，骨髓定量通常是首要参数，可反映流式细胞术对原始细胞负荷的估计，但与形态学原始细胞计数并不严格等同：部分形态学原始细胞可缺乏CD34表达，尤其伴单核细胞分化时；FCM定量通常在CD45⁺白细胞区室内进行，排除形态学评估包含的红系；骨髓血液稀释对免疫表型定量的影响可能更明显，因首次抽吸骨髓常用于形态学分析，故诊断报告需记录样本质量。尽管如此，骨髓myCD34⁺ HSPCs占全部白细胞比例仍是疑似MDS检查的关键参数，用于诊断导向和疾病分类；形态学原始细胞百分比仍支撑MDS-LB、MDS-IB1和MDS-IB2区分，尽管MDS与AML的原始细胞阈值存在争议（WHO为20%，国际共识分类（ICC）MDS/AML类别降至10%），且形态学观察者间变异明显。欧洲血液学协会（EHA）和欧洲白血病网（ELN）关于原始细胞协调评估的建议强调FCM与形态学互补；类似原则可用于MDS诊断时更精确分类，尤其区分MDS-LB与MDS-IB1。基于标准化采集方案、稳健设门策略和足够事件数，myCD34⁺ HSPCs的FCM定量具有较高实验室间可重复性，已纳入多数MDS的FCM诊断评分，但阈值不一。Ogata评分中初始2.4%阈值经多中心验证后调整为占全部有核细胞2%；超过2%视为异常并计1分，但单独不足以诊断，法国验证队列特异性达98%。Kern等提出的myCD34⁺ HSPCs阈值3%（通常指CD45⁺白细胞中）诊断判别力强，阳性预测值97.6%、阴性预测值48.3%，且>3%者98%具有符合MDS的细胞形态学特征并伴其他免疫表型异常，后续在独立队列验证。3%的FCM阈值可能对应形态学5%原始细胞阈值以识别原始细胞增多并支持MDS诊断。骨髓CD34⁺细胞减少为再生障碍性贫血特征，而低增生MDS中CD34⁺ HSPCs通常保留或增多，有助于鉴别诊断。上述阈值不可直接互换，取决于分母（全部有核细胞或CD45⁺白细胞）、分析前变量和设门策略。循环myCD34⁺ HSPCs定量亦有诊断价值，循环群体超过白细胞0.1%在独立队列中被报道对MDS相对特异。除诊断外，myCD34⁺ HSPC定量具预后意义：与骨髓形态学原始细胞百分比类似，FCM定量与临床结局相关；3%阈值与较差无白血病生存（LFS）和总生存（OS）相关且独立于IPSS-R，2% cutoff亦报道与OS相关；循环CD34⁺细胞>10 cells/μL亦与不良结局相关。myCD34⁺ HSPC定量已纳入若干FCM预后评分，但近期提出的FCM OS预后评分中最有信息量的变量未保留该参数，而CD34⁺ B细胞祖细胞（BCPs）定量被保留。总体而言，CD34⁺细胞定量可能是MDS FCM诊断中最直接、稳健且易标准化的参数之一。

3 CD34⁺祖细胞的免疫表型异常（IMMUNOPHENOTYPIC ABNORMALITIES OF CD34⁺ PROGENITORS）

除数量增加外，MDS中myCD34⁺ HSPCs还存在支持诊断的表型异常。定性免疫表型异常包括未成熟细胞上成熟抗原异步表达（成熟不同步）、谱系不忠实（髓系原始细胞表达淋系标记）、平均荧光强度（MFI）偏离正常钟形分布，以及正常祖细胞不表达抗原的异常表达。随着国际工作组标准化和指南推进，自2008年FCM纳入WHO分类以来，已识别MDS中反复、稳定的表型异常模式，可不依赖骨髓原始细胞百分比定义病态造血。借鉴AML可测量残留病（MRD）监测，可采用白血病相关免疫表型（LAIP）策略和白血病干细胞（LSC）策略识别myCD34⁺ HSPCs异常。MDS中主要LAIP型异常包括CD34 MFI增高（约30%低危MDS（LR-MDS））、CD117 MFI增高（37% LR-MDS）、CD13 MFI增高（24% LR-MDS）、CD33 MFI降低（21% LR-MDS）、CD45 MFI降低或增高（分别为19%和21% LR-MDS），以及淋系标记CD7、CD56、CD5或CD19异常表达（分别约5%、4%、4%和<0.5% LR-MDS）。LSC策略方面，LSC最早于2000年代在MDS中识别，但描述其完整表型及预后作用的数据较新。AML LSC研究进展促进MDS LSC认识，LSC标记如CD7、CD11b、CD22、CD33、CD44、CD45RA、CD56、CD123、CD366（TIM-3）、IL1-RAP或CD371（CLL-1）表达于myCD34⁺ HSPCs的CD34⁺CD38^?部分，定义免疫表型异常造血干细胞（IA-HSCs），亦称LSCs。关键研究显示约三分之一MDS患者存在LSCs，定义为至少10个细胞组成的簇异常表达CD33和/或CD44和/或CD123和/或CD45RA和/或CD7/CD11b/CD22/CD56/CD366/CD371之一；IA-HSCs存在独立于骨髓原始细胞计数，但识别CD34⁺CD38^?区室扩增及更严重血细胞减少的患者，并与白血病进展风险增加相关且独立于包括IPSS-R在内的常规危险因素。近期报道尝试连接免疫表型异常与分子或遗传发现：myCD34⁺ HSPCs的CD45 MFI异常降低（以淋巴细胞CD45 MFI归一化比值表示）与MDS-5q特异相关并纳入5参数del(5q)评分；低CD45 MFI亦常见于SRSF2突变患者，其粒细胞CD11b/CD16成熟模式异常；myCD34⁺ HSPCs异常CD5、CD7和CD56表达见于7号染色体异常患者。另有基于细胞物理性质而非常规标记表达的实时形变细胞术研究显示MDS患者CD34⁺细胞与健康受试者形变性不同，且与突变数相关。少数研究提示表型异常的诊疗影响：异常CD5、CD7或CD56表达与对粒细胞集落刺激因子（G-CSF）反应缺乏相关；红系定向祖细胞（ery-HSPCs，CD105⁺/CD36⁺/CD71⁺/CD34⁺）及CD117⁺红系祖细胞与红系刺激剂（ESAs）反应相关。

4 CD34⁺祖细胞亚群的异常分布（ABNORMAL DISTRIBUTION OF CD34⁺ PROGENITOR SUBSETS）

除CD34⁺ HSPCs数量和质量改变外，MDS骨髓CD34⁺区室还表现为明确定向祖细胞亚群分布异常。CD34⁺CD10⁺CD19⁺ B细胞祖细胞（BCPs）是最一致报道且具诊断相关性的群体。MDS骨髓中BCPs常减少，反映造血向髓系偏移；该参数单独敏感性和特异性不足，尤其老年人，但以总CD34⁺ HSPC区室归一化后诊断价值提高，所得原始细胞优势–血幼细胞（BDH）比值对MDS具敏感性和特异性。BCP定量常纳入复合评分系统如Ogata评分，总CD34⁺ HSPCs中比例<5%视为附加异常特征。除诊断价值外，CD34⁺ BCP定量可能提供MDS预后信息，在近期提出的FCM OS预后评分中被列为6个最有信息量变量之一。除BCPs外，多项研究更全面表征谱系定向CD34⁺祖细胞，显示多数MDS患者存在影响髓系和淋系祖细胞的多重成熟相关阻滞，可定量区分MDS与非MDS并识别高危疾病。CD34⁺ HSPCs分布随疾病进展演变：早期MDS常以常见髓系祖细胞（CMPs）积累为特征，而高危MDS与粒细胞–单核细胞祖细胞（GMPs）扩增及更未成熟CD34⁺CD38^?CD90⁺细胞更明显增加相关。基于HSPC结构的综合分析显示诊断时MDS干细胞存在两种主要分化状态，分别以CMPs或GMPs优先扩增为特征，并由不同遗传改变驱动；上游区室分析显示CMP优势病例与CD34⁺CD38^?细胞中CD45RA^?CD90⁺表型定义的长期造血干细胞（LT-HSCs）及多能祖细胞（MPPs）频率显著较高相关，而GMP模式MDS样本富集淋巴系定向多能祖细胞（LMPPs）。特定遗传亚型中亦描述反复表型模式：7号染色体单体常与LMPP样细胞积累（有时伴异常CD90共表达）及GMPs扩增相关；SF3B1突变MDS较其他亚型CD34⁺红系前体频率增加，但该特征似乎不影响ESAs反应；相反，SF3B1野生型MDS中基线总CD34⁺ HSPC区室内CD34⁺红系细胞比例较高者后续获持久ESA反应，提示CD34⁺红系祖细胞定量可能预测ESA反应。近期还发展出量化CD34⁺区室总体异质性的方法：基于特定祖细胞亚群（CMP样、GMP样或MEP样）选择性扩增及其他亚群减少，髓母细胞分歧指数被提出用于量化偏离正常骨髓祖细胞分布并识别大部分MDS病例；互补方法采用熵指标量化骨髓myCD34⁺细胞群表型异质性，反映细胞在表型定义亚群间分布多样性，显示诊断时大部分患者可检测分布改变，并与特定疾病特征相关。在两个独立队列中，CD34⁺CD38⁺ HSPC异质性熵定量分别于46%和47%患者降低，反映更深血细胞减少、更高IPSS-R风险及更高突变负荷的进展期疾病。CD34⁺ HSPCs分布详细分析亦提供预后信息：无监督聚类显示不同祖细胞亚群分布高度异质，从类似非MDS骨髓到类似AML谱系；特定亚群扩增如常见淋系祖细胞（CLPs）与较好结局相关，而GMP比例增加与白血病转化和疾病进展风险较高相关。两个独立队列进一步显示诊断时熵降低（相对于正常骨髓值定义）与不良预后强相关且独立于IPSS-R。纵向分析显示监测HSPC分布可提供疾病动态信息：随疾病进展，CD34⁺CD38⁺熵明显降低并与骨髓原始细胞计数增加平行；低危MDS随访中即使原始细胞计数稳定也可观察熵逐渐降低，提示祖细胞区室持续亚临床重塑；进展与CD34⁺ HSPC组成改变相关，包括LSCs和GMPs扩增，临床稳定患者亦常出现HSPC分布时间变化。部分高危MDS患者接受去甲基化药物（HMAs）治疗与CD34⁺CD38⁺熵部分恢复相关，但疾病传播干细胞仍持续存在于不同分化状态（LT-HSCs或LMPPs）。HMA失败后进展时可见CD34⁺CD38^? HSC区室扩增，谱系偏倚反映诊断时初始结构，即CMP模式病例CD45RA^?CD90⁺ LT-HSC扩增、GMP模式病例CD45RA⁺CD90^? LMPP扩增。扩增LT-HSCs转录组分析显示BCL2显著上调，提示对选择性BCL-2抑制剂venetoclax（ABT-199）潜在敏感；相反，LMPPs扩增驱动进展似乎更依赖NF-κB介导生存通路，且HMA失败后进展时以LT-HSCs为特征者对venetoclax为基础治疗反应更好。目前阿扎胞苷单药仍为高危MDS（HR-MDS）标准治疗，但MDS-IB2与MDS/AML（分别按WHO和ICC 2022标准）重叠扩大潜在venetoclax方案适用人群；VERONA试验中VEN+Aza组合未较阿扎胞苷单药改善中危和HR-MDS总生存，但不排除特定亚组获益。HSPC结构表征可能成为识别最可能受益于此类联合治疗患者的预测性生物标志物，需进一步研究验证LMPP或LT-HSCs驱动疾病状态与venetoclax敏感性关联后再临床实施。

5 CytHem-SMD工作组的反馈（FEEDBACK FROM THE CytHem-SMD WORKING GROUP）

法国CytHem-SMD工作组自2020年成立，分享MDS流式细胞术十余年经验，提供panel实施技术支持、解读建议及标准化报告意见。2020年全国初步调查显示，受调查42个中心（包括33个法国大学医院）中仅29%（n=12）开展MDS panel；开展分析的中心多数（8/12，67%）使用Ogata评分，最常用扩展形式（90%），仅三分之一（n=4）开展RED评分或成熟模式分析。基于实践回顾，工作组聚焦最常用的两套评分系统：扩展Ogata评分和RED评分。更全面评分系统如iFS和ELN评分整合更多参数可能诊断力更强，但在常规实验室尤其MDS流式经验有限者实施更具挑战；较简单评分更易实施和标准化但可能牺牲诊断敏感性。工作组认为扩展Ogata和RED评分在诊断性能与常规临床可行性间提供实用折中，尤其适合发展MDS流式活动的实验室。因此，法国流式网络CytHem成员可获得详细即用方案，包括每个panel的完整技术方案和注释设门策略，强调设门难点和潜在陷阱；方案针对临床常用CE-IVD标记流式细胞仪，目前适用于FACSCanto?、Navios?、FACSLyric?和DxFLEX?。还提供分析前和分析阶段建议，如骨髓采集后12 h内计算Ogata评分、获取至少500个CD34⁺细胞用于MFI计算。2021年引入涉及现场临床病例的实践工作坊后，2022年开展虚拟实验室间质量评估，向所有CytHem成员开放；两次虚拟评估（Ogata评分和RED评分）收到30余份回复，结果一致率94%。2026年新调查显示52个参与中心中MDS panel实施显著改善，23个中心（44%）开展专用panel，而2020年为12个中心。当前使用检测中扩展Ogata评分仍最常开展（16/23，70%），但LSCs专用panel（n=12，52%中心）或CD34⁺CD38⁺ HSPC熵测量显著增加，后者达到与红系前体分析相同频率（30%，7/23）。LSC分析增加可能部分归因于法国AML流式工作组标准化多中心方法推动的AML-MRD技术全国扩展；近期HR-MDS强化化疗后MRD评估预后价值证明支持祖细胞枚举临床相关性并可能促进MDS更广泛实施。为利用AML-MRD专长，工作组2023年建立的12色或13色panel与AML-MRD panel骨架标准化并基于其设计，可计算扩展Ogata评分和裂解版RED评分，也允许LSCs检测和定量及CD34⁺CD38⁺ HSPC熵测量。2026年计划开展聚焦熵测量和LSCs检测的新工作坊，随后进行全国实验室间质量评估。除开展MDS panel中心数增加外，CytHem-SMD成员非正式反馈提示，一旦质量保证的流式MDS分析常规可用，转诊血液科医生日益请求并将流式结果整合入诊断推理；该观察尚未正式量化，但与其他同道报告一致。工作组计划未来对转诊临床医生使用和信任流式MDS报告开展专门调查。

6 未来展望与结论（FUTURE PERSPECTIVES AND CONCLUSIONS）

MDS以广泛免疫表型异常为特征，不仅累及本综述详述的HSPCs，也累及粒细胞、单核细胞和红系成熟细胞。这些表型改变对诊断具重要价值，并日益被认识到具预后和诊疗潜力。2021年和2026年全国多中心调查强调，当前主要挑战之一仍是向更多参与疑似MDS诊断工作的实验室推广流式细胞免疫表型分析。该临床情境常见，尤其老年患者不明原因血细胞减少需骨髓检查；骨髓抽吸为侵入性操作，需最大化每份样本诊断和预后信息以优化患者管理。因此，FCM应与细胞形态学、细胞遗传学和分子分析一起更系统整合入疑似MDS评估。鉴于MDS风险年龄人群血细胞减少检查高 prevalence，需将FCM分析扩展至专家中心以外；更广泛实施要求方法稳健、可负担且易在常规实践部署。该领域面临明显悖论：通过评估更多信息标记最大化诊断敏感性和特异性，同时简化检测设计、实施和解读。近期 spectral flow cytometry 在临床诊断实验室的实施预计发挥关键作用；其在常规临床实践中日益可用是该领域重大技术进步，可在单管同时评估更多参数，促进更全面但操作简化的诊断策略。然而将这些方法转化为常规诊断实践尤其血细胞减少情境仍具挑战，需仔细标准化分析前和分析程序及稳健数据分析和解读方法；实施自动化和无监督分析方法亦为充分利用多维数据集复杂性所必需。无监督分析用于造血探索及MDS情境的可行性和临床相关性已获研究支持；CD34⁺区室评估可能日益依赖此类方法，轨迹类似AML MRD评估。CD34⁺CD38^?区室内HSPC异质性表征及推定白血病干细胞群体识别是高维无监督分析特别有吸引力的应用，可显著提高操作者间和实验室间可重复性并促进更广泛临床实施；除深化疾病生物学理解外，这些方法可能开辟新临床应用，包括纵向疾病监测和在新出现或加重血细胞减少患者中早期检测疾病进展，最终促进更早治疗干预和改善患者管理。总之，CD34⁺区室流式细胞术评估已从纯诊断工具演变为能够提供MDS诊断、预后和潜在预测信息的综合平台。未来结合先进流式技术、标准化抗体panel和人工智能驱动分析工具的发展，预期进一步增强CD34⁺细胞分析的临床效用，并促进MDS患者更个性化管理。