毛细管凝胶电泳凝胶材料的历史回顾与最新进展

《Journal of Chromatography A》：Historical Review and Recent Advances in Gel Materials for Capillary Gel Electrophoresis

　　

- 综述了毛细管凝胶电泳（CGE）中凝胶材料的历史及其最新研究进展。
- 比较了不同凝胶材料的凝胶机理和分子筛分特性。
- 总结了CGE凝胶材料的特征、局限性和应用领域。
- 探讨了CGE凝胶材料面临的挑战与未来创新方向。

**引言**

毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis, CGE）是20世纪60年代发展起来的一种分析技术，它以凝胶作为筛分介质，在电场驱动下使分析物在毛细管内迁移，基于分子大小和电荷数等固有的理化性质实现高精度、高通量的分离（图1）。CGE适用于蛋白质、肽类、寡核苷酸和DNA等生物大分子的分离与分析[1]。与传统的板状凝胶相比，CGE具有抗对流效果好、比表面积大、散热性能好、分辨率高、分析速度快以及定量更准确等优点。近年来，CGE受到了众多学者的广泛关注[2]。

CGE的起源可追溯至1983年，当时Hjertén[3]将聚合的聚丙烯酰胺凝胶填充至毛细管中，建立了早期形式的CGE。该方法解决了蛋白质在分离过程中对毛细管壁的吸附问题，并使大分子的分析成为可能。这项开创性工作推动了凝胶电泳在蛋白质组学、DNA测序和寡核苷酸分析领域的发展。1994年，Hjertén[4]及其同事报道了低熔点甲氧基化琼脂糖凝胶，该凝胶可以从毛细管中排出并重新填充，提供了热可逆、可更换筛分网络的早期实例。1995年，Chang和Yeung[5]使用未交联的线性聚(环氧乙烷)（PEO）进行毛细管电泳DNA分离，进一步推动了从固定凝胶向可更换缠结聚合物网络的转变。1996年，Menchen[6]及其同事通过含氟碳端基聚(乙二醇)（PEG）的自组装开发出可流动筛分网络，证明了可逆分子缔合能够将筛分能力与毛细管可重新填充性结合起来。进入21世纪以来，CGE筛分材料的发展日益从单纯改善可更换性转向对网络结构的更精确控制。2003年，Doherty[7]及其同事开发了稀疏交联聚丙烯酰胺纳米凝胶，通过小程度的共价交联提高了网络稳定性，同时保留了可更换性。2020年，You[8]及其同事构建了一种相对均匀、结构化的四臂PEG（Tetra-PEG）水凝胶网络，其更规则的网络结构提高了筛分均匀性，并应用于与单核苷酸多态性相关的分离。随后，Crihfield和Holland[9]报道了一种由磷脂自组装形成的热响应纳米凝胶。该材料无需传统的聚合反应，即可在非变性条件下实现蛋白质筛分，体现了动态、自组装和生物相容性材料的发展。更近期的研究中，Sárk?zy[10]及其同事采用四羟基硼酸盐介导的瞬态交联制备了琼脂糖筛分体系，用于在宽分子量范围内快速进行SDS-CGE分析治疗性蛋白质。综合来看，这些发展表明CGE的进步与筛分材料的创新密切相关。从早期的固定聚丙烯酰胺凝胶到可更换的聚合物基质，材料组成、结构和可调性的逐步变化提高了分离性能，拓展了CGE的应用范围。

凝胶是CGE的核心，因为它们不仅提供分离介质，还提供了分子筛分、抑制对流和样品聚焦等功能。这些功能有助于限制区带展宽和溶质分散，并减少与毛细管壁的相互作用。理想情况下，CGE筛分材料应具备适当且可调的有效孔径、足够的化学和机械稳定性、低非特异性吸附以及可控的电渗流[11]。这些理化性质相互依赖，共同影响网络孔径特征、溶胀、界面相互作用和分子传输，从而影响分析物的迁移阻力、有效筛分范围、选择性、分辨率、区带展宽、分析时间和重现性。因此，理解材料结构、网络性质与分离性能之间的关系对于理性设计和优化CGE基质至关重要。

近年来，毛细管电泳（CE）和CGE在生物分析领域的广泛应用推动了综述文章的增多。例如，我们研究组的Zhou[12]综述了基于CE的酶抑制剂筛选的进展，Liu[13]总结了CGE在生物大分子（包括蛋白质和核酸）检测中的应用。这些综述主要涉及CE和CGE的分析应用，而非系统地比较作为筛分介质的凝胶材料。由于这些材料是CGE性能的核心，评估其组成、凝胶化行为、结构特征、筛分机理和功能修饰有助于开发先进的基质并拓展CGE的应用。凝胶材料的化学结构、交联密度、分子量、亲水/疏水性、电荷状态和组装方式共同影响网络孔径特征、链段运动和分析物-基质相互作用。这些因素进而影响迁移阻力、有效筛分范围、选择性、区带展宽和分析重现性[[14], [15], [16], [17]]。特别是，CGE筛分介质已从传统的聚丙烯酰胺凝胶发展为线性聚合物、功能化聚合物、动态交联网络和纳米复合材料。不同的结构和组装机理赋予这些材料不同的筛分范围、选择性、稳定性和可更换性。本综述不重新划分CGE的应用领域，而是采用整合材料科学与分离科学的跨学科视角。讨论遵循材料组成、交联或组装机理、网络结构、分子筛分行为和分离性能的顺序展开。我们系统综述了不同CGE筛分材料的历史发展、结构特征、凝胶化或组装机理、代表性应用和局限性。重点讨论了可更换、动态、功能化和复合基质的最新进展，以及凝胶理化性质与分离性能之间的关系。本文旨在为针对不同大小和性质的生物大分子选择和设计CGE筛分介质提供基于材料的理论依据。

CGE筛分材料在化学组成和网络形成机理方面各不相同。因此，仅根据聚合物种类或是否存在交联进行分类是不够的。本文将聚合物筛分介质主要根据网络形成机理和链间连接的持久性进行分类。通过共价键形成永久性三维网络的材料被归为永久交联聚合物筛分介质。通过氢键、链间聚集、聚合物重叠和缠结或其他可逆非共价相互作用形成的体系被归为可逆聚合物筛分介质。化学交联聚丙烯酰胺是前者的代表，后者包括物理琼脂糖凝胶以及基于线性聚丙烯酰胺（LPA）、PEO、PEG、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和纤维素衍生物的动态筛分基质。这种分类方式强调网络形成而非聚合物的化学身份，避免了同一聚合物在不同物理形态下被不一致地分类。以下各节综述了毛细管凝胶电泳中凝胶材料的最新研究进展，旨在为构建标准化CGE系统以分离和分析不同类型和分子量的生物大分子提供理论参考。

**各节概要**

**凝胶材料的理化性质与CGE分离性能**

CGE筛分介质的理化性质并非独立地影响分离性能，而是通过聚合物网络结构和分析物-基质相互作用产生耦合效应。聚合物浓度和分子量影响链重叠、缠结程度和有效孔径，从而影响分析物的迁移阻力和尺寸选择性。同时，聚合物的化学结构和亲水/疏水性也影响溶液……

**永久交联聚合物筛分介质**

永久交联聚合物凝胶是通过共价键将聚合物链连接形成三维筛分网络的材料。与由链缠结或可逆非共价相互作用维持的物理筛分网络不同，这些凝胶具有相对稳定的三维结构。其有效孔径可通过单体总浓度、交联剂含量和聚合条件进行调整，从而实现基于尺寸的分离……

**可逆聚合物筛分介质**

可逆聚合物筛分介质是主要通过氢键、链间聚集、聚合物链重叠和缠结或其他可逆非共价相互作用形成筛分结构的体系，而非以共价交联作为主要凝胶化机理。在琼脂糖凝胶中，冷却诱导双螺旋形成和链间物理聚集，产生热可逆的三维网络。相比之下，LPA、PEO……

**纳米结构筛分介质**

纳米结构筛分介质是一类通过将纳米粒子、纳米结构单元或自组装组分引入聚合物基筛分体系而形成的复合筛分材料。与上述根据底层聚合物网络形成机理进行分类的永久交联和可逆聚合物筛分介质不同，纳米复合筛分材料在本节中单独讨论。这种区分并不意味着……

**结论与展望**

CGE的发展与基于凝胶的筛分介质的进步密切相关。这些材料从早期的化学交联聚丙烯酰胺凝胶（其机械稳定性有限），发展到更易操作的线性聚合物溶液（但存在一定的分辨率限制）。更近期的发展包括刺激响应性凝胶、兼具机械性能和筛分性能的纳米复合凝胶，以及旨在保留生物活性的仿生水凝胶。

**资助项目**

本研究受以下项目资助：科技部重点研发计划、国家重点研发计划"中医药现代化"项目（编号：2024YFC3505600 & 2024YFC3505603）；甘肃省基础创新群体科学基金（26JRRA004, 25JRRA469）；兰州市城关区科技支撑计划项目（2025KJZC00066）；国家自然科学基金青年科学基金。

**作者贡献声明**

高瑞：撰写初稿、概念构思。张雅婕：调查研究。杨从刚：验证。李凡凡：方法学。王伟峰：监督指导。张颖：撰写—审阅与编辑。杨军丽：撰写—审阅与编辑，经费获取。

**利益冲突声明**

作者声明不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

**致谢**

本研究受以下项目资助：科技部重点研发计划、国家重点研发计划"中医药现代化"项目（编号：2024YFC3505600 & 2024YFC3505603）；甘肃省基础创新群体科学基金（26JRRA004, 25JRRA469）；兰州市城关区科技支撑计划项目（2025KJZC00066）；国家自然科学基金青年科学基金。

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