《Journal of Chromatography A》：Rapid and comprehensive determination of 44 plant toxins causing food poisoning by liquid chromatography–tandem mass spectrometry using a transient ion-pair approach
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本文开发了一种用于检测44种植物毒素的快速分析方法。
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本文开发了一种用于检测44种植物毒素的快速分析方法。
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样品通过三氯乙酸脱蛋白和去除脂质进行制备。
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三氯乙酸改善了高极性生物碱的色谱峰形。
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实验室间验证确认了该方法对大多数毒素的检测准确性和精度为1 mg/kg。
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该方法已应用于日本岐阜县的一起食物中毒事件。
引言
食物borne疾病主要由细菌、寄生原生动物、蠕虫或病毒引起。然而，有些病例是由生物体自然产生的化学物质（称为天然毒素）引起的[1]。天然毒素引起的急性症状从相对轻微的呕吐和腹泻到严重的心脏传导异常[2]、肝肾衰竭[3]和神经系统疾病[4]不等，在最严重的情况下甚至可能致命[4]。天然毒素可分为几类，包括蘑菇毒素、霉菌毒素、藻类毒素和植物毒素[1]。
植物毒素通常是植物为了抵御病原体和食草动物而产生的次级代谢物[5]。这些毒素可能污染食物或被意外摄入，从而对健康构成严重风险。在日本，1961年至2011年的50年间共报告了463起由植物毒素引起的食物中毒事件，涉及5,699名患者，导致26人死亡[6]。导致中毒的植物主要包括Datura、Brugmansia、Veratrum属植物，以及Aconitum属植物，其次是Phytolacca americana、Narcissus属植物、Solanum tuberosum、Scopolia japonica、Alocasia odora和Coriaria japonica。大多数病例是由于将形态或名称相似的可食用植物误认所致；然而，有些事件是由于Solanum tuberosum含有高水平的生物碱（由于栽培不当）、未适当处理的未成熟Prunus mume或过量摄入Ginkgo biloba造成的。与食物中毒相关的大多数植物毒素是生物碱，其他类别还包括氰苷、类固醇（包括甾体苷）、萜类化合物（包括三萜苷）和芳香化合物（见图S1）[7,8]。
当前用于检测食物中植物毒素的分析方法通常结合通用样品制备方法（如QuEChERS[9]或简单的“稀释-注射”方法[10]），与靶向液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）或非靶向液相色谱-高分辨率质谱（LC–HRMS）[10, [11, [12, [13, [14, [15, [16, [17]]）结合使用。这些方法主要用于同时检测具有已知最大限量（MLs）的植物毒素（如托品烷生物碱、吡咯里西啶生物碱和生物碱[18, [19, [20, [21]]）以及其他污染物，包括农药残留、兽药和霉菌毒素。然而，在日本，除了氰苷中的氢氰酸外，尚未为其他植物毒素设定最大限量，而且分析方法主要是为应对个别食物中毒事件而开发的，而非用于常规监测。由于引起食物中毒的植物毒素种类繁多，开发一种适用于所有情况的综合分析方法是非常具有挑战性的，尤其是对于罕见病例中的微量毒素。此外，现有的综合方法通常仅适用于特定基质，如饮料或血浆[22,23]。因此，开发一种广泛适用的方法对于准确估计食物残渣中的毒素剂量至关重要，尤其是在难以精确量化的复杂基质中。
本研究开发了一种专门针对植物毒素的快速且全面的分析方法，该方法几乎涵盖了在日本导致食物中毒的所有有毒植物，并在三个实验室进行了验证，以评估其在应急响应中的适用性。根据过去日本食物中毒事件的频率和风险评估的需要，选择了44种植物毒素作为分析目标（见表S1）。为了应急使用，优化了高通量样品制备和LC–MS/MS条件，以便在单一方法中分析从高极性到非极性的各种分析物。这尤其具有挑战性，因为高极性化合物在传统的C18柱上的保留效果较差，难以与非极性化合物同时进行分析。通常，高极性植物生物碱通过使用酸性流动相（pH 2–3）的HPLC进行分析，其中含有几毫摩尔到几十毫摩尔的烷基磺酸盐（例如庚烷磺酸盐）或烷基磺酸酯（例如十二烷基硫酸钠）作为离子对试剂，以增强色谱保留并提高结构相似化合物的分辨率[24, [25, [26, [27, [28, [29]]）。为了检测碱性分析物，还向HPLC流动相中添加了诸如高氯酸盐和全氟酸盐等盐析离子对试剂[30,31]。同样，三氯乙酸也被用作离子对试剂[32]。然而，由于挥发性较低，这些离子对试剂通常不适合用于LC–MS流动相。为了克服这些限制，本研究探索了一种称为“瞬态离子对色谱”的新方法，其中将原本用于样品制备中蛋白质沉淀的三氯乙酸（TCA）有意保留在最终提取液中，并引入LC–MS/MS系统。与传统的离子对色谱不同，这种方法不在流动相中添加离子对试剂。残留的三氯乙酸预计会在高极性化合物洗脱的早期保留时间区域发挥离子对作用，从而增强C18相的保留效果并改善色谱峰形，同时保持LC–MS/MS的兼容性。使用实际含有高浓度分析物的有毒植物样品评估了所开发分析方法的适用性。最后，该方法被用于调查岐阜县一起由Narcissus叶子引起的食物中毒事件。
部分摘要
食物和有毒植物样本
本研究使用的食物样本包括菠菜（一种富含水分和色素的植物来源样本）、元宵（日式饺子；一种富含脂质和蛋白质的混合来源样本）和咖喱（一种富含脂质和香料的混合来源样本）。菠菜和冷冻元宵（来自日本东京的Ajinomoto Frozen Foods）是从超市购买的，未经烹饪直接使用。元宵的主要成分包括卷心菜、洋葱、葱（Allium tuberosum）、大蒜、猪肉、鸡肉和豆蛋白。
LC–MS/MS分析的优化
根据日本过去食物中毒事件的频率和风险评估的需要，选择了44种植物毒素作为分析目标（见表S1）。由于LC–MS/MS的限制，排除了白肾豆中的凝集素、Alocasia odora中的草酸钙晶体和Cicuta virosa中的多炔毒素等化合物。
虽然超高效液相色谱是LC–MS/MS的一种非常通用的方法，但由于其对压力的耐受性限制，未能得到广泛应用。
结论
本研究开发了一种快速且全面的方法，用于识别和定量属于27个已知导致食物中毒的植物群的44种植物毒素。通过使用TCA作为酸化剂和蛋白质沉淀促进剂，并结合Captiva EMR-Lipid cartridges去除脂质，实现了高效快速的样品制备。TCA的盐析效应还改善了高极性生物碱植物毒素的保留效果和色谱峰形。
CRediT作者贡献声明
Minatani Tomiaki: 构思、数据管理、正式分析、研究、方法学、项目管理、验证、可视化、撰写——初稿。 Taniguchi Masaru: 数据管理、正式分析、研究、方法学、验证、可视化、撰写——初稿。 Tomozawa Junko: 研究、可视化、撰写——审核和编辑。 Takeuchi Hiroshi: 研究、可视化。 Ota Kosuke: 验证、撰写——审核和编辑。 Masayuki
资金来源
本研究得到了卫生、劳动与福利科学研究资助（食品安全研究，H30-Food-General-008）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
补充材料 与本文相关的补充材料可以在文章的在线版本中找到（doi：）
数据可用性
本研究的支持数据可在合理请求并获得共同作者许可的情况下，从相应作者处获得。
CRediT作者贡献声明
Minatani Tomiaki: 撰写——初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、研究、正式分析、数据管理、构思。 Taniguchi Masaru: 撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理。 Tomozawa Junko: 撰写——审核与编辑、可视化、研究。 Takeuchi Hiroshi: 可视化、研究。 Ota Kosuke: 撰写——审核与编辑。 Takahashi Masayuki:
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：
Minatani Tomiaki报告称获得了卫生、劳动与福利部的财政支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢坂井市公共卫生研究所的Shinto Masanori提供的持续和专业的建议；岐阜县健康与环境科学研究所的Nozaki Naoko和Yokoyama Akane在提取工作方面的协助；国家健康科学研究院的Kawasue Shimba对稿件的宝贵意见；以及国家警察科学研究院的Ohta Hikoto的有益讨论。
Tomiaki Minatani | Masaru Taniguchi | Junko Tomozawa | Hiroshi Takeuchi | Kosuke Ota | Masayuki Takahashi | Miou Toda
