《Journal of Chromatography A》：Development of a Multi-Detector Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation Method for Characterization of a Protein Nanoparticle Antigen Co-formulated with a Squalene-based Nanoemulsion Adjuvant
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•开发了一种AF4方法来分离两种纳米颗粒群体。•该方法在测量粒径、形状和Mw的同时实现了基线分离。•热应激会导致粒径分布重叠。•无论是否存在佐剂，抗原中低Mw物种的形成情况相似。引言疫苗包含多种多样的复杂形式，包括但不限于蛋白质–多糖偶联物、病毒样颗粒（VLPs）和脂质纳米颗
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开发了一种AF4方法来分离两种纳米颗粒群体。
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该方法在测量粒径、形状和Mw的同时实现了基线分离。
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热应激会导致粒径分布重叠。
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无论是否存在佐剂，抗原中低Mw物种的形成情况相似。
引言
疫苗包含多种多样的复杂形式，包括但不限于蛋白质–多糖偶联物、病毒样颗粒（VLPs）和脂质纳米颗粒（LNPs）。对这些疫苗形式进行表征这一具有挑战性的任务因佐剂的加入而更加复杂，而佐剂在许多现代疫苗中是关键组分。佐剂是有意添加的，用于增强和调节免疫反应，其常见组分包括铝盐、脂质体、多糖或皂苷类颗粒，以及含有角鲨烯等油类的纳米乳剂[[1], [2], [3], [4], [5]]。因此，疫苗制剂通常含有多个分散相和胶体物种，必须单独且联合理解，以确保彻底的产品表征和质量。
从分析角度来看，抗原和佐剂都可能表现出明显的多分散性，粒径从数纳米到数百纳米不等。粒径是纳米材料的常见关键质量属性（CQA），因为广泛的颗粒聚集或解聚会影响产品性能。批量动态光散射（DLS）通常用于监测粒径变化，然而结果会受最大颗粒的偏倚。由于这一局限性，在没有先分离抗原和佐剂的情况下，难以准确表征含佐剂疫苗。此外，抗原和佐剂的物理化学性质可能使它们易与色谱固定相发生二次相互作用，或在剪切应力下发生结构变化。这些挑战对传统的基于尺寸的分离技术，如体积排阻色谱（SEC），尤其相关。尽管SEC广泛用于生物制药表征，但其填充的多孔固定相和柱内的剪切环境可能导致非特异性吸附，并降低大或脆弱聚集体的回收率，具体取决于柱孔径和粒径、流动相组成和流速。对于疫苗组分——例如VLPs、LNPs和水包油纳米乳剂——这些局限性可能导致粒径分布偏倚、低估高级别聚集体以及质量回收不完全，从而降低对CQA评估方法适用性的信心。
在过去二十年中，不对称流场流分（AF4）已成为表征复杂生物制药产品（包括疫苗）的一种强大的替代分离技术[[6], [7], [8], [9]]。AF4提供本质上更低的剪切条件和高度可调的分离机制，可容纳从几纳米到几微米尺寸的物种[10]。在AF4中，分离发生在薄的开放通道中，而不是填充柱内。样品通过层流纵向流沿通道运输，同时垂直的横向流将分析物推向形成通道一壁的半透膜（图1）。分析物在其扩散远离膜的倾向与横向流推向膜的力之间建立平衡分布。较小的颗粒，其扩散系数较高，能够迁移到更高层流区域，因此较早洗脱。相反，较大的颗粒留在更靠近膜的慢速流区域，较晚洗脱。
由于AF4依赖于开放通道和膜而非填充柱，它最小化了可能破坏大或脆弱聚集体的剪切力和物理约束。此外，该方法可通过选择横向流大小和梯度、通道高度、载液组成和膜类型进行精细调节，使其高度适应不同的疫苗形式和制剂条件。然而，该技术并非没有局限性，因为聚焦时间、膜相互作用和横向流等因素也可能导致样品损失和结构变化。AF4通常与多个下游检测器一起使用，例如紫外（UV）吸收、折光率（RI）、多角度光散射（MALS）和动态光散射（DLS）。这种检测器组合可实现对抗原和佐剂多个关键属性的同时测量，包括重均摩尔质量（Mw）、颗粒浓度、粒径分布、回转半径、流体力学半径和形状相关参数。
几组研究已使用基于AF4的方法研究脂质体和LNPs的稳定性，无论是在简单缓冲液中还是在血清蛋白存在下，以更好地了解降解途径以及与生物基质的相互作用[[11], [12], [13], [14]]。SEC–MALS和AF4–MALS对偶联疫苗的对比研究突出了AF4在解析大偶联物方面的优势，特别指出脆弱的复合物在经过SEC柱时可能被剪断[15,16]。最近，电AF4（EAF4）——除横向流外还应用电场，基于大小和电荷分离物种——被用于测量纳米乳剂佐剂的粒径和zeta电位，为其稳定性和与抗原及其他制剂组分相互作用的潜力提供了见解[17]。
尽管有这些进展，文献中关于使用AF4表征同一制剂中抗原和佐剂仍存在明显空白。许多先前报告的研究专注于单独的抗原或佐剂，或研究它们与血清组分的相互作用[11,12,14,18]。因此，评估抗原和佐剂共制剂时潜在相互作用的数据有限。弥补这一空白至关重要，因为抗原–佐剂相互作用有可能影响免疫原性和整体产品稳定性。
在本研究中，我们描述了一种AF4方法的开发和优化，以分离和表征一种蛋白质纳米颗粒抗原和一种商业化角鲨烯基纳米乳剂佐剂AddaS03?。工作重点关注AF4方法开发中的关键考虑因素，包括横向流梯度设计和筛选、膜材料的选择，以及抗原和佐剂的样品回收率评估。优化后的方法在蛋白质纳米颗粒和纳米乳剂群体之间提供了优异的分辨率，能够详细评估粒径分布和聚集行为。
最后，我们应用该方法评估抗原和佐剂单独及共制剂样品的热稳定性。通过比较受控应激条件下的粒径和聚集谱，我们研究纳米乳剂佐剂对抗原稳定性的潜在影响。总的来说，结果表明AF4分离可以优化以提供疫苗制剂的见解，并突显了AF4作为疫苗开发和表征技术的更广泛潜力。
章节摘要
材料
AddaS03?（与许可佐剂AS03不同）购自InvivoGen公司（加利福尼亚州圣地亚哥）。AddaS03?是一种纳米乳剂，由5% v/v角鲨烯、5% v/v α-生育酚和1.8% v/v聚山梨酯80（PS80）组成[19]。在进行纳米乳剂组分的浓度计算时，使用以下密度：0.858 g/mL（角鲨烯）、0.950 g/mL（α-生育酚）和1.064 g/mL（PS80）[[20], [21], [22]]。牛血清白蛋白（BSA）购自Thermo Fisher Scientific公司
横向流梯度筛选
方法开发从评估几种线性和指数横向流梯度开始，从1、2或3 mL/min开始，在20分钟内降至0（图S1）。初始筛选的目标是确定提供抗原和AddaS03?基线分离的条件。所有筛选方法均在带有250 μm隔片和10kDa MWCO再生纤维素膜的短通道上进行。梯度筛选的结果表明，所有三种线性梯度
讨论
AF4与多个下游检测器联用提供了表征复杂疫苗制剂的有效方法，然而本研究中遇到的若干挑战突出了进一步改进的机会。AddaS03?的样品回收率为71-74%，尽管对AF4方法而言是可以接受的，但仍表示向膜损失了大量材料，并为佐剂表征数据增加了不确定度。此外，膜表面在
结论
在本研究中，我们开发了一种AF4方法，用于表征含佐剂的疫苗制剂。该方法能够分辨未受应激的共制剂抗原和佐剂样品，同时测量Mw、Rh和Rg等关键属性。然而，在受应激后，由于抗原和佐剂之间的粒径分布部分重叠，该方法无法完全分辨所有颗粒群体。据作者所知，这是首次使用AF4
数据可用性
当前研究期间生成的数据集可应合理要求从通讯作者处获取
CRediT作者贡献声明
Troy Halseth：撰写–初稿、概念化、方法学、调查研究、正式分析，Jarrod Cohen：撰写–审阅和编辑、概念化，Emory Payne：撰写–审阅和编辑、概念化，Ray McClain：撰写–审阅和编辑，Sarah Aubert：撰写–审阅和编辑、资源。
资金
本研究资金完全由默沙东西屋公司（默沙东公司的子公司）提供，美国新泽西州拉韦伊市。
CRediT作者贡献声明
Troy Halseth：撰写–初稿、方法学、调查研究、正式分析、概念化。Jarrod Cohen：撰写–审阅和编辑、概念化。Emory Payne：撰写–审阅和编辑、概念化。Ray McClain：撰写–审阅和编辑。Sarah Aubert：撰写–审阅和编辑、资源。
利益冲突声明
作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
Troy Halseth|Jarrod Cohen|Emory Payne|Ray McClain|Sarah Aubert
