在线固相萃取耦合LC-MS/MS定量母乳中氯法齐明、利奈唑胺、左氧氟沙星和莫西沙星及其在耐药结核治疗妇女中的临床应用

《Journal of Chromatography B》：Quantification of clofazimine, linezolid, levofloxacin, and moxifloxacin in breast milk by online solid phase extraction coupled to LC-MS/MS

　　

研究人员建立了母乳中氯法齐明（clofazimine）、利奈唑胺（linezolid）、左氧氟沙星（levofloxacin）和莫西沙星（moxifloxacin）的定量方法，采用新型在线固相萃取（online SPE）耦合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）从母乳中提取并分析多种分析物；将该方法应用于接受耐药结核病（DR-TB）治疗妇女的样本；并评估血浆与母乳浓度之间的相关性。

研究背景方面，耐药结核病（drug-resistant tuberculosis, DR-TB）治疗中二线抗结核药物在母乳中的暴露资料有限。部分抗结核药在母乳中暴露较高，可能影响婴儿安全，也可能对母乳喂养婴儿具有预防作用。氯法齐明（clofazimine）、利奈唑胺（linezolid）、左氧氟沙星（levofloxacin）和莫西沙星（moxifloxacin）是WHO近期缩短的耐多药结核病（multidrug-resistant TB, MDR-TB）治疗方案中的关键药物。氯法齐明原用于麻风病，后重新用于DR-TB；其微晶混悬液吸收率约45%～62%，高脂餐可增加生物利用度，作用机制尚未完全明确，半衰期长、蛋白结合率高且高度亲脂，可蓄积于皮下组织并致皮肤变色，也可蓄积于富脂基质，并与其他延长QT间期药物合用时需监测QT。利奈唑胺为噁唑烷酮类抗生素，通过干扰分枝杆菌核糖体蛋白合成发挥作用，口服生物利用度完全且不受食物影响，血浆蛋白结合约31%，半衰期3.4～7.4 h。左氧氟沙星和莫西沙星均为氟喹诺酮类，血浆蛋白结合分别约38%和45%，生物利用度高，可口服或静脉给药，作用机制为抑制细菌复制所需DNA旋转酶。药物从母体血浆转运至母乳受蛋白结合、母体血浆浓度、分布容积、分子量（<800 Da更易进入）、弱碱性药物在较酸母乳（pH 7.2）中离子捕获、半衰期和亲脂性等因素影响。已有资料显示，接受氯法齐明治疗的母亲母乳喂养婴儿可出现暂时性红黄色皮肤变色，并在母体治疗结束后数月消退；母乳中氯法齐明浓度报道为0.8～1.7 μg/mL。利奈唑胺母乳浓度报道为12.4 μg/mL（600 mg口服后2 h峰值）、9.75和18.7 μg/mL（第1天和第14天）以及3.5～12.2 μg/mL。左氧氟沙星500 mg每日给药后稳态母乳浓度5 h为8.2 μg/mL，另有500 mg口服后2.5和3 h分别为0.265和0.258 μg/mL。莫西沙星母乳资料稀缺，有研究描述HPLC荧光衍生化定量方法但未应用于临床样本。由于数据有限且缺少可靠定量方法，研究人员开展本研究。

研究人员开发并验证两种互补、连续的LC-MS/MS方法，从单份50 μL母乳样本中定量四种药物，采用简单样本前处理，并应用在线固相萃取（online solid phase extraction, online SPE）。方法应用于两项临床研究：King Dinuzulu Hospital（KDH）纵向观察研究（Durban, KwaZulu-Natal）和BEAT-Tuberculosis（Building Evidence for Advancing New Treatment for Tuberculosis study）开放标签、多中心、随机对照试验（南非）样本。莫西沙星未包含在两研究方案，但因南非BPaLM方案推荐而纳入多重方法，以备未来DR-TB研究。作者称据其所知首次报告氯法齐明、利奈唑胺和左氧氟沙星母乳浓度与母体血浆浓度比较。研究结论为方法准确、精密、灵敏、选择、稳健并成功应用；意义为提供母乳浓度以帮助评估DR-TB药物在母乳喂养妇女及婴儿中的安全性和有效性。

关键技术方法约250字：研究人员采用online SPE耦合LC-MS/MS，建立两个按极性分组的在线SPE程序：氯法齐明用Synergi Hydro-RP 100? C₁₈柱提取、Poroshell 120 EC-C₁₈柱分离，并以同向洗脱转移；利奈唑胺、左氧氟沙星和莫西沙星用Restek Viva BiPh柱提取、反向洗脱至Poroshell 120 EC-C₁₈柱分离。50 μL母乳经含内标的乙腈-甲醇（50:50, v/v）沉淀、离心和稀释后进样，电喷雾正离子多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）检测。验证包括精密度、准确度、稳定性、灵敏度、选择性、残留、特异性、回收率、工艺效率、基质效应和合并用药影响。空白母乳来自Milk Matters母乳库；临床样本来自KDH研究（n=5）和BEAT-Tuberculosis研究（n=4）。

3.1 方法开发：通过质谱参数优化和提取/色谱条件考察，研究人员发现四种药极性差异大，同一提取程序不能同时充分保留氯法齐明和极性药物；混合模式SPE对极性药满意但氯法齐明保留不足，C₁₈疏水柱在适合极性药条件下氯法齐明提取不一致，因此采用两种在线SPE程序。氯法齐明在Synergi Hydro-RP 100? C₁₈柱上同向洗脱，形成窄带并转入分析柱；极性药在双苯基柱上保留并反向洗脱，少极性基质被保留后冲入废液。母乳批间和批内不一致，可溶性基质成分可能改变SPE柱保留和分析物洗脱时间窗，故需定期运行质量控制（quality control, QC）并调整时间窗。结论为建立按极性分组的互补online SPE-LC-MS/MS方法。

3.2 方法验证：按FDA和EMA要求评估。标准曲线采用二次加权（1/浓度）回归，范围分别为氯法齐明0.0477～6.00 μg/mL、利奈唑胺0.191～24.0 μg/mL、左氧氟沙星和莫西沙星均为0.240～30.2 μg/mL，相关系数0.9990～0.9999；QC结果准确度和精密度良好。稳定性显示储备液在~?80 °C稳定：氯法齐明245天、利奈唑胺和左氧氟沙星271天、莫西沙星25天；基质在~?80 °C至少稳定94天（氯法齐明）、44天（利奈唑胺）、87天（左氧氟沙星和莫西沙星），在~?20 °C均稳定26天；三次冻融和~30 °C 4 h台面放置稳定；自动进样器~8 °C下氯法齐明批次需78.2 h内、其他三药需69.4 h内重新进样。灵敏度：利奈唑胺、左氧氟沙星、莫西沙星平均信噪比（signal-to-noise ratio, S/N）为41.7、51.2、39.7；氯法齐明以基线噪声计S/N为42.6，以空白提取样本背景峰高计为5.81，空白峰面积≤最低定量下限（lower limit of quantification, LLOQ）的18%。选择性、残留、检测特异性均符合标准。平均回收率为68.0%、94.1%、104.5%、106.0%；工艺效率为66.9%、93.6%、105.0%、107.5%；基质效应斜率变异2.6%、1.5%、2.7%、2.4%；合并用药存在时高、低QC差异0.1%至?3.7%，CV为1.1%～8.3%。结论为方法准确、精密、灵敏、选择、稳健，内标可充分补偿基质影响，合并用药不干扰。

3.3 临床应用：将方法用于KDH（n=5）和BEAT-Tuberculosis（n=4）样本，血浆和母乳在给药前及给药后2、4、6 h采集，BEAT另采集8和24 h。血浆浓度范围为氯法齐明0.062～0.490 μg/mL、利奈唑胺6.52～19.7 μg/mL、左氧氟沙星0.304～16.8 μg/mL。母乳中氯法齐明1.67～7.30 μg/mL（每日50或100 mg，体重依赖），高于既往0.800～1.70 μg/mL，且高于配对母体血浆；作者解释与其高度亲脂及母乳富脂有关。母乳利奈唑胺1.48～21.3 μg/mL（每日600 mg），高于既往最高12.2 μg/mL。母乳左氧氟沙星0.432～22.0 μg/mL（每日500～1000 mg，体重依赖），高于既往0.258～8.20 μg/mL。虽然样本量较少，但证明方法可用于临床研究样本，并可未来用于更大样本。结论为药物母乳浓度可测，部分药物母乳浓度高于血浆或既往报道。

讨论部分总结：研究人员指出方法只需50 μL样本、前处理简单、online SPE减少样本制备时间、体积和材料，并能利用不同柱亲和；但母乳基质不一致要求定期QC监测。研究提供母乳中四种药定量工具和临床暴露数据，有助于评估DR-TB治疗母乳喂养妇女及婴儿的安全性和有效性。据研究人员所知，这是首次比较氯法齐明、利奈唑胺和左氧氟沙星母乳与母体血浆浓度。研究结论翻译：研究人员开发并验证了两种互补的定量方法，采用online SPE耦合LC-MS/MS测定母乳中氯法齐明（clofazimine）、利奈唑胺（linezolid）、左氧氟沙星（levofloxacin）和莫西沙星（moxifloxacin）。该方法在存在内源性基质成分时仍表现出准确度、精密度、灵敏度和选择性，证实其稳健性。该方法已成功应用于临床研究样本分析。本研究希望通过提供母乳中药物浓度水平，帮助科学家和临床医生评估DR-TB药物在母乳喂养妇女及其婴儿中的安全性和有效性。