《Journal of Controlled Release》：Ionizable lipid impact on mRNA vaccine formulation properties and immunogenicity
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摘要COVID-19大流行扰乱了全球供应链，导致mRNA疫苗生产所需的关键脂质类原料短缺。为增强配方的韧性，我们系统评估了五种可电离脂质（ILs）对脂质纳米颗粒（LNP）内部结构、mRNA递送及免疫原性的影响。理化分析揭示了液晶层状（Lα）和反相六方相（HII）相可能在所制备
摘要
COVID-19大流行扰乱了全球供应链，导致mRNA疫苗生产所需的关键脂质类原料短缺。为增强配方的韧性，我们系统评估了五种可电离脂质（ILs）对脂质纳米颗粒（LNP）内部结构、mRNA递送及免疫原性的影响。理化分析揭示了液晶层状（Lα）和反相六方相（HII）相可能在所制备的LNP配方中共存，或者存在负载核苷酸与未负载核苷酸的HII相混合结构。此外，具有饱和多尾结构的ILs，如Lipid-5和SM-102，倾向于形成反相六方相（HII）内部结构和融合中间体，这与增强的内体融合及更高的体内蛋白表达相关。相比之下，具有双电离头基、倾向于形成层状结构的ILs如cKK-E12，表现出较低的包封效率和转染效力。临床前实验表明，所有开发的配方均能诱导强烈的结合抗体和中和抗体反应；然而，mRNA Lipid 5 LNP和mRNA SM-102 LNP的抗体反应低于其他配方。值得注意的是，在本研究的有限IL范围内，蛋白表达水平与抗体滴度之间未显示出明确的相关性，这表明高效的抗原表达本身并不能预测体液免疫。这些发现强调了IL结构特征如何影响LNP的架构和功能，为下一代mRNA疫苗的理性设计提供了信息。
引言
COVID-19大流行导致的供应链中断引起了某些原料的短缺，尤其是脂质类材料 [1], [2]。这些脂质是mRNA疫苗所用脂质纳米颗粒（LNP）配方中不可或缺的 [3], [4]。FDA批准的配方严重依赖于特定的可电离脂质（ILs），如SM-102和Acuitas ALC-0315。需求激增和有限的供应商产能导致脂质生产和疫苗制造的延误 [5], [6]。因此，需要测试多种LNP配方以多元化供应，而非专注于特定的配方。
由于ILs具有pH响应特性，能够实现mRNA的高效包封和受控释放，在LNP配方中起着主要作用 [7], [8], [9]。包封对于保护mRNA免受核酸酶降解、促进细胞摄取以及实现内体逃逸至关重要。ILs的结构特征对LNP的膜融合性、内体逃逸和蛋白表达具有巨大影响 [10], [11]。虽然最近的进展引入了多种不饱和和多尾ILs，具有增强的膜融合和mRNA递送能力 [7], [8], [9]，但促进内体逃逸的具体结构-功能关系仍不完全清楚。例如，MC3——一种双尾IL，每条链含有两个双键——与SM-102和ALC-0315（不含双键）相比，显示出较低的融合活性和蛋白表达 [7]。值得注意的是，SM-102和ALC-0315具有分支尾链 [12]，这很可能促进了增加的负曲率，可能影响其促融合特性。ILs结构的差异影响免疫反应的激活 [9], [10], [13]，为LNP设计增加了另一层复杂性。因此，有必要比较不同ILs在LNP配方中用于mRNA递送及整体疫苗免疫原性的功效，以减少对特定IL制造的依赖。
为此，我们全面评估了五种不同ILs在LNP配方中对mRNA疫苗免疫原性的功效。理化表征提供了Lα和HII相可能共存于LNP中的证据，或者存在负载核苷酸与未负载核苷酸的HII相混合结构。此外，具有多尾和饱和烷基链的ILs——如Lipid 5和SM-102——促进了LNP内部形成高度有序的反相六方相（HII）纳米结构，并在用1 μg荧光素酶（Fluc）mRNA免疫的BALB/c小鼠中实现了更高效的内体融合和显著更高的体内蛋白表达。相比之下，cKK-E12具有独特的头基化学结构，其双电离胺基形成层状组织，这与降低的包封效率和转染效力相关。这很可能表明ILs促进负界面曲率的结构倾向性直接增强了mRNA递送和翻译。
我们在用5 μg RBD mRNA免疫的BALB/c小鼠中进行的临床前研究表明，所有开发的配方均表现出高结合抗体和中和抗体反应。值得注意的是，蛋白表达水平与抗体滴度之间未观察到相关性，这表明抗原表达本身可能无法预测体液免疫原性。总体而言，我们在研究中所用的ILs有潜力被应用于mRNA疫苗。
章节摘要
mRNA-LNP的内部纳米结构组织
为评估ILs在LNP配方中的效率，我们制备了五种含有编码荧光素酶（Fluc，533 kDa）或SARS-CoV-2受体结合域（RBD，229 kDa）三聚体mRNA的不同LNP。我们的配方由不同的ILs（Lipid 5、SM-102、ALC-0315、MC3或cKK-E12；结构见图1a）、磷脂（DOPE）、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质组成，除cKK-E12外，所有配方的恒定摩尔比为50:10:38.5:1.5，cKK-E12的摩尔比制备于
结论
总体而言，对五种mRNA疫苗配方的临床前评估，每种含有不同的IL（Lipid 5、SM-102、ALC-0315、MC3和cKK-E12），表明均能诱导强烈的结合抗体和中和抗体反应。然而，由于蛋白表达无法预测抗体反应，LNP设计必须兼顾高效的递送和强大的免疫激活。尽管许多研究报告了使用Lipid 5、SM-102、ALC-315和cKK-E12相比MC3改进了蛋白表达
CRediT作者贡献声明
Shahad K. Alsaiari：撰写——初稿、可视化、方法论、形式分析、数据管理、概念化。Brendan Dyett：可视化、方法论、形式分析、数据管理。John Daristotle：撰写——审稿与编辑、验证、方法论。Lisa H. Tostanoski：方法论、形式分析。Haitao Yu：方法论、形式分析。Jiali Zhai：方法论、形式分析。Seba Nadeef：方法论、形式分析。Timothy A. Forster：方法论、形式分析。
资金来源
本工作部分由Koch研究所支持（核心）拨款P30-CA14051（来自国家癌症研究所）以及King Faisal专科医院与研究中心（KFSHRC）资助。我们感谢麻省理工学院材料科学与工程学院的工程材料实验室提供的技术支持。
致谢
S.N.感谢阿卜杜勒阿齐兹国王科学与技术城提供的伊本·赫勒敦（IBK）奖学金。B.D.感谢澳大利亚研究理事会发现早期研究员奖（DE230101504）的支持。本研究部分在澳大利亚同步辐射装置的SAXS/WAXS束线完成，该装置是ANSTO的一部分。作者感谢RMIT微纳研究设施（MNRF）提供设备和资源的使用权限。作者感谢King Faisal专科医院的Hazem Ghebeh博士
Shahad K. Alsaiari | Brendan Dyett | John Daristotle | Lisa H. Tostanoski | Haitao Yu | Jiali Zhai | Seba Nadeef | Timothy A. Forster | Sevinj Mursalova | Calum J. Drummond | Charlotte E. Conn | Falah Almohanna | Dan H. Barouch | Jackie Y. Ying | Robert Langer | Ana Jaklenec
