NSUN3介导的tRF5-GlyTCC m5C修饰经RPL23相关核仁应激与p53相关自噬抑制结直肠癌进展并增强5-FU敏感性

《Advanced Science》：NSUN3-Associated m5C Modification of tRF5-GlyTCC Suppresses Colorectal Cancer Progression via RPL23-Linked Nucleolar Stress and p53-Associated Autophagy and Enhances 5-FU Sensitivity

　　

转运RNA衍生小RNA（tRNA-derived small RNAs，tsRNAs）调控肿瘤中的基因表达和细胞应激反应，但其在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）进展和化疗反应中的作用仍未完全阐明。研究人员通过RNA测序鉴定CRC中失调的tsRNAs。采用体外实验和体内异种移植模型评估tRF5-GlyTCC的功能。通过生物信息学分析、荧光素酶报告基因实验、蛋白质印迹和免疫荧光研究其靶点和分子效应。通过甲基化RNA免疫沉淀定量PCR（MeRIP-qPCR）评估m⁵C修饰。tRF5-GlyTCC在CRC组织中下调，并与晚期疾病和不良预后相关。恢复tRF5-GlyTCC可抑制体外CRC细胞生长和迁移以及体内肿瘤生长。tRF5-GlyTCC与RPL23 3′UTR相互作用，并与核糖体稳态改变、核仁应激、p53信号和自噬相关。恢复tRF5-GlyTCC增强5-FU敏感性，而其agomir在体内增强5-FU的抗肿瘤作用。NSUN3介导的m⁵C修饰促进tRF5-GlyTCC稳定性。NSUN3介导的m⁵C修饰促进tRF5-GlyTCC稳定性，该稳定性与核糖体稳态、核仁应激反应和p53信号相关。该网络促进CRC中的肿瘤抑制和化疗反应。

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）存在肿瘤异质性、转移潜能及5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）方案反应差异，亟需可靠生物标志物并阐明进展与治疗反应机制。转运RNA衍生小RNA（tRNA-derived small RNAs，tsRNAs）参与基因表达和细胞应激调控，但tRF5-GlyTCC在CRC中的功能尚不清楚；RPL23为60S核糖体亚基组分并与p53信号相关，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m⁵C）修饰可影响tRNA稳定性和tsRNA生成。研究人员系统分析tRF5-GlyTCC的表达、临床意义、功能及调控机制，发现其在CRC中显著下调并与侵袭性临床特征和不良总生存相关；恢复tRF5-GlyTCC可抑制CRC细胞增殖、迁移和体内肿瘤生长，并通过RPL23相关核仁应激（nucleolar stress）、p53信号及自噬相关反应增强5-FU敏感性；NSUN3（NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员3）相关m⁵C修饰促进tRF5-GlyTCC稳定性。该研究将tsRNA稳定性、核糖体/核仁应激与化疗敏感性相联系，为CRC潜在诊断和治疗靶点提供依据。论文发表在《Advanced Science》。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员收集2020年9月至2023年6月南通大学附属医院99对CRC及癌旁组织，其中97对用于表达与临床分析、6对用于小RNA测序；采用小RNA测序和转录组测序、RT-qPCR、体外功能实验（CCK-8、EdU、克隆形成、Transwell）、HCT116异种移植模型、双荧光素酶报告实验、Western blotting、免疫荧光、MeRIP-qPCR、放线菌素D（ActD）追踪实验、表面翻译传感（SUnSET）实验、透射电子显微镜（TEM）和基因集富集分析（GSEA），并进行5-FU剂量反应及氯喹（CQ）干预。

3.1 tRF5-GlyTCC在CRC组织中显著下调并与不良临床结局相关：通过6对组织小RNA测序筛选差异tsRNAs，RT-qPCR验证三个下调候选，tRF5-GlyTCC下降最明显；97对组织验证其低表达，CRC细胞系低于NCM460；低表达与总生存缩短、T分期、淋巴结转移和TNM晚期相关。

3.2 tRF5-GlyTCC在体外抑制CRC细胞增殖和迁移：通过mimic/inhibitor调控水平，CCK-8和EdU显示过表达降低细胞活力和DNA合成，抑制则相反；Transwell显示过表达降低迁移，抑制增强迁移。

3.3 tRF5-GlyTCC直接靶向RPL23 3′UTR并抑制其表达：整合TargetScan/miRanda预测与转录组筛出RPL23等候选；双荧光素酶显示mimic降低RPL23-WT报告活性，突变结合区取消该效应；Western blotting示过表达降低RPL23、抑制升高RPL23；CRC组织RPL23升高且与tRF5-GlyTCC负相关，RPL23高表达与恶性临床特征相关；通路富集示RPL23与p53相关信号相关。

3.4 tRF5-GlyTCC在与RPL23相关p53信号相关联的情况下促进自噬：GSEA示p53和自噬通路富集；Western blotting示过表达增p53、LC3-II、ATG5、LAMP1/2并降p62；CQ处理进一步增LC3-II并减弱p62下降，支持自噬流增强；TEM见过表达增自噬体、抑制减少；RPL23沉默增p53。

3.5 对RPL23相关核仁应激和p53信号的进一步机制认识：免疫荧光示RPL23沉默引起核磷蛋白（NPM1）由核仁向核质重分布，tRF5-GlyTCC抑制单独不明显且未明显逆转；Western blotting示RPL23敲低增p53；SUnSET示过表达未显著改变整体蛋白合成；p53-GFP报告示过表达增p53活性；RPL23敲低增p53和LC3II、降p62。

3.6 RPL23与恶性表型相关并参与tRF5-GlyTCC的作用：RPL23在CRC细胞高表达；siRPL23抑制增殖、克隆形成和迁移；共转tRF5-GlyTCC抑制剂与siRPL23可部分减弱抑制tRF5-GlyTCC所致的增殖和迁移增强，支持RPL23参与其效应。

3.7 tRF5-GlyTCC过表达在体内抑制肿瘤生长并增强CRC对5-FU敏感性：CCK-8剂量反应示过表达降低5-FU的IC₅₀，CQ部分逆转增敏；HCT116异种移植中agomir抑瘤，联合5-FU更显著降低肿瘤体积和重量；免疫组化示联合组Ki-67、PCNA、RPL23最低、p53最高；RT-qPCR证实agomir增加瘤内tRF5-GlyTCC。

3.8 NSUN3介导的m⁵C修饰促进tRF5-GlyTCC稳定性：预测并经MeRIP-qPCR验证前体tRNA-Gly-TCC C66区域m⁵C富集；NSUN3在CRC组织和细胞低表达；敲低NSUN3降tRF5-GlyTCC但不显著改变前体丰度，并降低C66区域m⁵C；NSUN3与tRF5-GlyTCC正相关；ActD追踪示NSUN3敲低加速tRF5-GlyTCC衰减并缩短半衰期；NSUN3敲低增RPL23并降p53/LC3II、增p62；GSEA示NSUN3与p53相关信号正相关；NSUN3预后关联随TP53突变状态不同。

讨论部分总结：作者提出NSUN3相关m⁵C修饰维持tRF5-GlyTCC稳定性，tRF5-GlyTCC降低伴随RPL23升高；RPL23扰动伴NPM1重分布、p53信号和自噬相关反应，但未确立核仁应激为p53激活的必需中间，也未进行siRNA抗性RPL23回补；SUnSET不支持整体翻译关闭；CQ部分减弱5-FU增敏支持自噬相关过程贡献；体内瘤内agomir具概念验证意义，但系统递送、分布、安全性和耐药场景未解决；NSUN3相关m⁵C与前体C66区域相关并维持成熟tRF5-GlyTCC稳定性，但未证明NSUN3直接甲基化C66或为唯一机制；模型不表示严格线性因果，仍需更多验证。

研究结论翻译：总之，研究人员将tRF5-GlyTCC鉴定为一种在CRC中下调并与侵袭性疾病特征相关的肿瘤抑制性tsRNA。研究结果表明，tRF5-GlyTCC直接调控RPL23，并与核仁应激相关p53信号和自噬相关反应相关，从而参与CRC进展和5-FU敏感性。在上游层面，NSUN3相关m⁵C修饰促进tRF5-GlyTCC稳定性，提供额外的表观转录组调控层。总之，这些发现将tsRNA调控与核糖体和核仁应激反应及化疗敏感性相联系，并为进一步研究tRF5-GlyTCC作为CRC潜在治疗靶点提供概念验证支持。