《Advanced Science》：ZMIZ2–DUX4–LGR5 Signaling Axis Maintains Stemness Properties and Facilitates Docetaxel Resistance in Triple-Negative Breast Cancer
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三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，治疗方法有限且频繁出现化疗耐药。通过对多西他赛耐药细胞系和三个公开可用的多西他赛耐药TNBC数据集进行整合RNA-seq分析，研究人员鉴定出锌指M
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，治疗方法有限且频繁出现化疗耐药。通过对多西他赛耐药细胞系和三个公开可用的多西他赛耐药TNBC数据集进行整合RNA-seq分析，研究人员鉴定出锌指MIZ型包含蛋白2（zinc finger MIZ-type containing 2, ZMIZ2）是TNBC化疗耐药的关键介导因子。ZMIZ2在TNBC组织和化疗耐药标本中显著上调，并与临床化疗反应呈负相关。功能研究表明，ZMIZ2促进癌症干性相关特性、恶性进展和多西他赛耐药。机制上，ZMIZ2通过其MIZ结构域直接结合转录因子DUX4，并与SWI/SNF染色质重塑复合物核心组分BRG1和BAF57相互作用，协同激活LGR5的转录。该ZMIZ2–DUX4–LGR5轴维持肿瘤细胞干性相关特性并促进肿瘤发生，从而驱动治疗耐药。研究人员还发现甘草苷（liquiritin）是一种ZMIZ2抑制剂，可与多西他赛协同作用，有效增强肿瘤消退。综上，研究结果确立ZMIZ2为一个有前景的治疗靶点，并为克服TNBC多西他赛耐药提供了潜在策略。
**ZMIZ2–DUX4–LGR5信号轴：三阴性乳腺癌干性与多西他赛耐药的新机制及治疗策略**
**一、研究背景与科学问题**
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）作为乳腺癌中最具侵袭性的亚型，约占全部乳腺癌病例的15%–20%，以高侵袭性、快速进展和不良预后为特征。以紫杉类药物（如多西他赛和紫杉醇）联合蒽环类药物（如表柔比星和多柔比星）或铂类药物为代表的新辅助化疗虽在TNBC治疗中显示出良好疗效，但相当比例的患者仍会产生耐药，导致治疗失败。因此，阐明化疗耐药的分子机制并识别新的治疗靶点，是改善TNBC患者预后的迫切需求。
癌症干细胞（cancer stem cells, CSCs）具有自我更新能力和多向分化潜能，在肿瘤复发、转移和治疗耐药中发挥关键作用。越来越多的证据表明，乳腺癌干细胞（breast CSCs, BCSCs）促成TNBC的高复发率和远处转移率，并在耐药和免疫逃逸中扮演核心角色。
锌指MIZ型包含蛋白2（zinc finger MIZ-type containing 2, ZMIZ2）是一种转录共激活因子，包含核定位序列（nuclear localization sequence, NLS）、msx互作锌指（MIZ）结构域和C端富含脯氨酸区域。已有研究将ZMIZ2与前列腺癌、结肠癌和肝细胞癌等多种实体瘤的进展相关联，其作用机制涉及增强STAT依赖性转录及与SWI/SNF染色质重塑复合物组分的相互作用。尽管ZMIZ2在多种恶性肿瘤中的作用已有报道，但其在TNBC化疗耐药中的特定功能及潜在分子机制尚未被充分阐明。
多西他赛耐药仍是TNBC面临的主要临床挑战，亟需识别新的治疗靶点和策略。本研究通过整合RNA测序、生物信息学、分子生物学及体内外功能实验，鉴定了ZMIZ2作为TNBC进展和化疗耐药的关键介导因子，并发现甘草苷（liquiritin, LIQ）作为ZMIZ2的新型靶向小分子抑制剂，在临床前模型中增强多西他赛对高表达ZMIZ2的耐药TNBC细胞的治疗效果。
**二、关键技术方法**
本研究采用了多项关键技术。研究人员通过6个月逐步剂量递增方案建立了MDA-MB-468R和MDA-MB-231R两种多西他赛耐药细胞系，并对亲本与耐药细胞进行RNA-seq分析。同时整合三个公开的多西他赛耐药TNBC数据集（GSE21974、GSE162285和GSE250632）进行交叉验证。蛋白质相互作用研究采用免疫共沉淀、GST pull-down和质谱（mass spectrometry, MS）分析；染色质层面的调控采用染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq）和ChIP-qPCR。转录调控验证使用双荧光素酶报告基因实验。此外还运用了AlphaFold2蛋白质结构预测、分子对接、表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）和细胞热位移分析（cellular thermal shift assay, CETSA）等药物筛选技术。临床样本来自中国医科大学第一医院和中国医科大学附属肿瘤医院，包括82例接受多西他赛新辅助化疗的TNBC活检标本（队列1）和86例未接受治疗的手术切除标本（队列2，45例非TNBC和41例TNBC）。
**三、研究结果**
**3.1 ZMIZ2作为TNBC多西他赛耐药新型介导因子的鉴定及其临床相关性**
通过RNA-seq和三个公共数据集的交叉分析，ZMIZ2是唯一在四个队列中一致上调的基因。免疫印迹和RT-qPCR证实了耐药亚系中ZMIZ2在蛋白和mRNA水平的表达上调。在82例接受多西他赛新辅助化疗的TNBC患者队列中，非病理学完全缓解（non-pathological complete response, non-pCR）组的ZMIZ2表达显著高于pCR组，且与Miller–Payne分级呈强负相关（R = ?0.631, p < 0.001）。在86例未治疗患者标本中，ZMIZ2阳性率在TNBC组织（80.49%）中显著高于非TNBC组织（22.22%），并与晚期病理TNM分期正相关。Kaplan–Meier分析显示高ZMIZ2表达与较短的无远处转移生存期相关。
**3.2 ZMIZ2增强TNBC恶性表型并赋予多西他赛耐药**
功能实验表明，ZMIZ2敲低显著降低耐药细胞的IC50值、提高凋亡率、抑制增殖、集落形成、迁移和侵袭；ZMIZ2过表达则产生相反效应。原位乳腺肿瘤模型进一步证实，ZMIZ2敲低显著抑制肿瘤生长，而在接受多西他赛的小鼠中，ZMIZ2敲低组肿瘤体积最小。
**3.3 ZMIZ2通过其MIZ结构域作为DUX4的转录共激活因子**
通过质谱数据与JASPAR转录因子数据库及GSE162285数据集的交叉分析，DUX4被确定为唯一的候选转录因子。内源性和外源性免疫共沉淀及GST pull-down实验证实了ZMIZ2与DUX4的直接物理结合。结构域定位实验表明，该相互作用主要依赖于ZMIZ2的MIZ结构域。在41例TNBC组织中，ZMIZ2与DUX4蛋白水平呈强正相关（R = 0.7531, p < 0.0001），免疫荧光证实二者在细胞核内共定位。
**3.4 DUX4促进TNBC恶性进展和多西他赛耐药**
DUX4在TNBC组织中的阳性率和染色强度显著高于非TNBC组织（73.17% vs. 15.56%）。DUX4过表达使MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的IC50值显著升高，并增强增殖、集落形成、迁移和侵袭能力；DUX4敲低则抑制这些恶性表型。
**3.5 ZMIZ2与BRG1和BAF57协同促进DUX4介导的LGR5转录**
通过RNA-seq和ChIP-seq数据整合分析，鉴定出LGR5、KITLG、PCDH10和TMEM232四个共调控靶基因，其中干性相关LGR5是最显著上调的基因。ChIP-qPCR证实DUX4结合于LGR5启动子区域，且该结合依赖于ZMIZ2。双荧光素酶报告基因实验显示ZMIZ2和DUX4协同激活LGR5启动子活性。免疫共沉淀证实ZMIZ2与SWI/SNF复合物核心组分BRG1和BAF57形成复合物。BRG1或BAF57敲低可消除ZMIZ2–DUX4诱导的LGR5转录激活。
**3.6 ZMIZ2–DUX4–LGR5轴增强TNBC干性相关特性和致瘤性**
ZMIZ2和DUX4共转导显著上调干性标志物CD133和CD44的表达，增强成球能力，并增加ALDH阳性细胞比例。极限稀释异种移植实验证实ZMIZ2过表达增强致瘤性，而DUX4或LGR5敲低则削弱这一效应。
**3.7 ZMIZ2通过DUX4依赖机制促进TNBC耐药和恶性表型**
ZMIZ2和DUX4共过表达使IC50值显著高于单因子过表达组，而DUX4敲低可逆转ZMIZ2过表达引起的耐药效应。凋亡实验、集落形成和Transwell实验均验证了这一DUX4依赖性机制。原位肿瘤模型进一步证实DUX4敲低可显著削弱ZMIZ2的促肿瘤作用。
**3.8 甘草苷通过靶向ZMIZ2增敏TNBC对多西他赛的反应并抑制干性特征**
通过AlphaFold2结构预测和分子对接筛选，甘草苷被鉴定为与ZMIZ2结合最稳定的化合物。SPR和CETSA实验验证了二者的有效结合。甘草苷显著降低LGR5表达而不影响ZMIZ2和DUX4本身的表达水平。在ZMIZ2敲低细胞中，甘草苷的作用消失，证实其靶向特异性。联合用药实验显示，甘草苷与多西他赛协同抑制耐药细胞的集落形成、迁移、侵袭和移植瘤生长，并降低成球能力和ALDH阳性细胞比例。
**四、讨论与结论**
本研究表明ZMIZ2在多西他赛耐药TNBC中高表达，并与不良预后显著相关。机制上，ZMIZ2作为转录共激活因子，通过MIZ结构域结合DUX4，并与SWI/SNF染色质重塑复合物组分BRG1和BAF57协同作用，促进DUX4介导的LGR5转录激活。该ZMIZ2–DUX4–LGR5轴维持肿瘤细胞干性相关特性，最终导致TNBC的耐药和恶性进展。研究存在一定局限性：缺乏完整的随访数据限制了生存分析的深度；尚无直接证据表明ZMIZ2在LGR5位点促进DUX4依赖性染色质重塑；LIQ对ZMIZ1的特异性也有待进一步验证。尽管如此，甘草苷作为新型ZMIZ2靶向小分子药物，与多西他赛联用通过靶向ZMIZ2–DUX4–LGR5轴破坏耐药TNBC细胞的干性维持，为克服TNBC多西他赛耐药提供了新的策略和实验基础。该研究发表于《Advanced Science》。
