Deanna方案（DP）改善携带家族性阿尔茨海默病突变的人iPSC皮层神经元缺陷的研究

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Deanna Protocol Ameliorates the Deficits in Human iPSC-Cortical Neurons Carrying Familial Alzheimer's Mutation

　　

目的：Deanna方案（DP）是一种回补性（anaplerotic）、基于机制设计的疗法，旨在修复受损的细胞能量流。本研究旨在利用携带PSEN1突变的阿尔茨海默病（AD）患者iPSC来源的皮层神经元，研究DP治疗AD的效果，并以健康受试者iPSC分化的皮层神经元作为对照。 方法：研究人员对PSEN1皮层神经元进行DP急性（24小时）和慢性（1–3周）处理。通过TMRE实验评估线粒体功能，免疫荧光染色评估AD神经元形态病理，全细胞膜片钳记录评估神经元电生理特性，微电极阵列（MEA）分析长时程增强（LTP）评估神经环路功能，以此评估DP的治疗效果。 结果：PSEN1皮层神经元表现出线粒体功能受损、病理标志物升高、神经突复杂性降低、电生理特性改变以及LTP减弱。DP处理显著改善了上述所有表型。 结论：本研究在证实iPSC-PSEN1皮层神经元作为有效AD模型的同时，证明了DP在改善AD神经元结构和功能病理方面的有效性。研究强调靶向能量产生可能是治疗AD神经退行性病变的有效途径，并提示该方法在其他神经退行性疾病中可能具有潜在疗效。

论文解读文章

一、研究背景与目的

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性神经退行性疾病（neurodegenerative disorder，ND），也是全球范围内最常见的痴呆病因。其病理特征表现为细胞外淀粉样蛋白-β（amyloid-β，Aβ）斑块的积聚和细胞内由过度磷酸化tau蛋白组成的神经原纤维缠结，最终导致突触丢失和渐进性神经退行。家族性AD由PSEN1、PSEN2和APP等基因的常染色体显性突变引起，其中PSEN1突变最为常见，约占基因分型阳性家族中的75%，且常与侵袭性早发性疾病相关。

传统动物模型和永生化细胞模型在理解AD机制和开发干预措施方面存在转化相关性有限的重大障碍，尤其缺乏人类特异的遗传和生理背景。人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）技术能够生成保留供体遗传背景（包括致病突变）的神经元，从而弥补这一差距。iPSC来源的皮层神经元（iPSC cortical neurons，iPSC CNs）为研究AD相关的功能和病理变化提供了生理相关系统。

能量耗竭——主要源于线粒体功能障碍和葡萄糖代谢受损——被公认为神经退行性疾病的核心机制，可导致突触衰竭、蛋白聚集体（如Aβ和tau）堆积、氧化应激、炎症乃至细胞死亡。因此，靶向能量缺乏可能是神经退行性疾病的有效治疗策略。Deanna方案（Deanna Protocol，DP）最初为肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）开发，是一种代谢补充方案，包含精氨酸-α-酮戊二酸（arginine-alpha-ketoglutarate，AAKG）、辅酶Q10、中链甘油三酯和GABA类似物等成分，旨在绕过受损的能量通路并支持线粒体功能。DP对线粒体功能和细胞代谢的积极作用及其对ALS的治疗效果已在SOD1-G93A小鼠模型、人iPSC运动神经元ALS模型以及iPSC来源的ALS神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）模型中得到证实。

鉴于DP对线粒体和细胞代谢以及ALS疾病的明确作用，本研究旨在探讨DP是否对AD——一种同样存在细胞代谢损伤的不同神经退行性疾病——具有治疗作用。具体而言，研究人员将在人源iPSC皮层神经元AD模型中研究DP修复电生理功能缺陷和减轻细胞病理（淀粉样蛋白和tau）的效果。

二、主要关键技术方法

本研究使用了以下主要技术方法：通过TMRE（tetramethylrhodamine ethyl ester，四甲基罗丹明乙酯）荧光实验评估线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）和能量能力；采用免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）染色分析神经丝（neurofilament，NF）、微管相关蛋白2（MAP2）、淀粉样蛋白沉积和磷酸化tau（phospho-tau，P-tau）等结构病理标志物；运用全细胞膜片钳电生理记录分析神经元兴奋性和放电特性；使用微电极阵列（microelectrode array，MEA）分析长时程增强（long-term potentiation，LTP）评估神经环路功能。细胞来源方面，携带PSEN1^A246E突变的皮层神经元购自Cedars Sinai，野生型（WT）基因型（ND41865）购自Corriell Institute。DP为市售产品（TDP-AAKG1），核心成分为α-酮戊二酸（AKG）和γ-氨基丁酸（GABA），以专利配比组成。

三、研究结果

2.1 DP增强PSEN1皮层神经元的线粒体功能

通过TMRE荧光检测发现，在DIV21（24小时DP处理）和DIV28（1周DP处理）时，PSEN1 DP?神经元的TMRE信号均低于WT对照组，符合AD神经元中公认的线粒体功能障碍和氧化应激特征。DP处理显著提高了PSEN1神经元的TMRE荧光，表明线粒体功能得到改善。值得注意的是，WT神经元在DP处理后TMRE信号有所降低，这可能与TCA中间体供应增加导致ATP产生增强、质子梯度释放引起MMP降低有关。

2.2 长期DP处理增加PSEN1皮层神经元NF强度并减弱tau磷酸化

在DIV35经3周DP处理后进行免疫细胞化学分析。结果显示，PSEN1神经元的NF信号强度显著低于WT神经元，DP处理显著提高了WT和PSEN1神经元的NF强度，提示DP可能部分稳定或保存神经元的轴突完整性。P-tau免疫反应性分析表明，PSEN1 DP?神经元的P-tau水平显著高于WT，DP处理后明显降低，且当以NF归一化后该降低仍然显著，表明tau磷酸化减少并非由于轴突突起丢失所致。

2.3 DP减少PSEN1皮层神经元的淀粉样蛋白聚集

在DIV35经3周DP处理后，使用MAP2染色评估树突结构，使用Methoxy-X04标记检测淀粉样蛋白聚集信号。结果显示，PSEN1 DP?神经元的Methoxy-X04信号较WT培养物显著增加，而DP处理的PSEN1神经元Methoxy-X04染色明显减少。MAP2荧光强度定量显示PSEN1 DP?神经元的MAP2信号较WT降低，DP处理增加了PSEN1神经元的MAP2强度。Methoxy-X04荧光定量证实PSEN1培养物中Aβ聚集显著增加，DP处理显著降低，且以MAP2归一化后仍然显著，表明Aβ信号减少并非由于树突突起减少所致。

2.4 DP降低PSEN1皮层神经元的过度兴奋性

皮层过度兴奋是AD关键的早期病理特征。在DIV21经1周DP处理后进行膜片钳电生理分析。与WT神经元相比，PSEN1神经元表现出更高的自发放电活动（100%的PSEN1神经元显示自发放电，而WT为50%）和去极化诱发的重复放电增加。DP处理降低了这两种放电活动。此外，PSEN1神经元在自发放电中频繁表现出爆发性放电模式（54.54%对WT的24.24%），这是过度兴奋的典型标志，DP处理减少了WT和PSEN1中表现爆发性放电的神经元数量。

2.5 DP增强PSEN1皮层神经元的网络可塑性

通过MEA分析评估群体神经活动和神经环路功能。在DIV35系统中，HFS后WT和WT+DP系统在刺激后即刻、1小时和24小时均观察到放电频率增加；而PSEN1系统中，HFS未能诱导活动增加，且在HFS后1小时出现放电频率显著降低，表明LTP诱导失败和突触可塑性缺陷。DP处理提高了PSEN1系统的1小时和24小时LTP，其中24小时LTP的升高具有统计学显著性。纵向分析显示，DIV21时PSEN1系统的LTP振幅高于WT系统（与过度兴奋表型一致），DIV28时PSEN1系统的LTP低于WT，DIV35时PSEN1系统的LTP降低对1小时和24小时LTP均具有统计学显著性，而2周DP处理有效纠正了这些缺陷。这一纵向LTP分析展示了PSEN1功能表型随时间的发展过程——从早期过度兴奋到随后提前衰退——与临床疾病进展中早期癫痫随后功能衰退的特征相符。

四、讨论与结论

讨论部分总结：DP由三种成分组成：α-酮戊二酸（AKG）、l-精氨酸（l-Arg）和GABA。AKG是三羧酸（TCA）循环的中间体，参与细胞中多种代谢和调控通路，补充AKG可直接通过向TCA循环补充碳源恢复氧化磷酸化。l-Arg作为双极碱基用于中和酸性AKG，同时作为化学伴侣防止蛋白质错误折叠，并作为一氧化氮（NO）的前体发挥神经保护作用。GABA作为抑制性神经递质，有助于对抗兴奋性毒性并恢复兴奋-抑制平衡，且GABA分流是TCA循环的碳进入（回补）途径。研究假设代谢功能障碍是ND共有的核心致病事件，其中糖酵解通量从丙酮酸转向乳酸导致糖酵解与TCA循环功能脱节，造成神经元能量衰竭。DP通过AKG绕过丙酮酸阻断、重新激活TCA循环，GABA恢复抑制张力并限制兴奋性毒性，精氨酸中和AKG酸性并生成NO增强微血管灌注，从而直接解决ND的能量根源问题。

研究结论翻译：本研究证明，向AD神经元重新引入AKG和GABA可正常化线粒体膜电位，保持神经元结构（以NF和MAP2分析为特征），降低AD病理标志物淀粉样蛋白和P-tau，抑制神经元过度兴奋，并通过LTP分析重新建立神经环路的突触可塑性。DP代表一种回补性疗法，直接解决ND的能量根源而非下游疾病修饰。鉴于生物能量不足是多种神经退行性病理的基础，DP可能提供统一的代谢治疗平台。其成分具有生理性且耐受性良好，有利于转化应用及与其他线粒体或NAD⁺增强疗法联合使用。本研究中代谢恢复与电生理恢复的趋同支持能量缺乏是神经退行性变的关键驱动因素，DP为其逆转提供了可行且机制扎实的途径。