《Journal of Membrane Science》：Incorporation of Danaparoid to enhance anticoagulant activity of hollow fiber membranes
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通过polyDOPA涂层，将Danaparoid（DP）定位于自制及商品化中空纤维膜（HF membranes）的血液接触表面。与共混法相比，Danaparoid与polyDOPA的涂层方法可获得更高的抗因子Xa（anti-factor Xa）活性。在中空纤维
通过polyDOPA涂层，将Danaparoid（DP）定位于自制及商品化中空纤维膜（HF membranes）的血液接触表面。与共混法相比，Danaparoid与polyDOPA的涂层方法可获得更高的抗因子Xa（anti-factor Xa）活性。在中空纤维膜内再循环（recirculation）2小时后，血浆（plasma）中未检测到可测量的Danaparoid泄漏。与未修饰膜相比，涂覆Danaparoid的商品化膜在纤维腔（lumen）内显示出更低的污染（fouling）和细胞沉积（cell deposition）形成。
研究背景：终末期肾病（ESKD，肾功能不可逆衰竭需肾脏替代治疗）患者通常需要血液透析（HD，利用透析器清除代谢废物）治疗，全球依赖HD者超过300万人，患者增长给医疗机构带来显著挑战。HD通常每周3次、每次4小时，使用含数千根中空纤维膜（HF membranes，透析器内用于血液净化的纤维状分离膜）的透析器。现有透析膜虽能有效清除小分子水溶性化合物，但血液与膜表面相互作用可引起蛋白吸附、血小板活化、膜污染（fouling）和血细胞沉积（cell deposition）；纤维腔内血细胞沉积会降低有效膜面积、损害透析性能，并可能导致血栓形成和血栓栓塞事件。已有策略包括采用三醋酸纤维素（CTA）等本征血液相容性更佳的聚合物，以及通过表面改性或共混抗凝材料（如肝素模拟聚合物）增强血液接触面局部抗凝活性。糖胺聚糖（GAGs，天然线性多糖，具抗凝等生物活性）包括硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸软骨素（CS）/硫酸皮肤素（DS）、硫酸角质素和透明质酸，可抑制凝血因子XIIa、XIa、IXa、Xa和IIa。将GAGs引入HF膜有望减少腔内血细胞沉积和血栓形成、改善透析性能并降低血栓栓塞风险，还可能减少患者全身抗凝需求，尤其有益于肝素诱导的血小板减少症（HIT）患者。Kim et al.既往通过共混将GAGs引入平板及HF混合基质膜（MMM），并首次对平板MMM进行血液相容性研究，发现DP（HS、CS和DS混合物）较其他GAGs具有更高血液相容性和抗凝活性；但DP在HF膜血液接触层高效定位的最佳策略尚未充分研究。因此，Roberto Nese等比较了DP和肝素在膜制备过程中共混引入与膜形成后涂层引入的抗凝性能。
研究方法概述：研究人员制备含共混DP、共混肝素及无GAGs的自制聚醚砜/聚乙烯吡咯烷酮（PES/PVP）HF膜，并构建微型透析器；采用两步后修饰涂层，先以polyDOPA（由L-DOPA氧化自聚合形成的黏附涂层）沉积于纤维腔表面，再沉积DP或肝素，并应用于自制PES/PVP膜及商品化Nipro Elisio 19 HX和FX1000膜。关键技术包括扫描电镜（SEM，观察膜形貌）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR，表征表面化学）、免疫染色与共聚焦显微镜（检测DP分布）、清洁水通量和牛血清白蛋白（BSA，评价膜筛分性能的模型蛋白）筛分系数、抗因子Xa活性管式与微型透析器测定、血浆再循环后凝血酶生成（thrombin generation，凝血潜能综合检测）及抗因子Xa活性、以及人血体外透析中肌酐（creatinine，小分子尿毒症毒素代表）清除和血压监测。人血及血浆来自University of Twente的TechMed Centre和Sanquin donor center健康供者，获伦理批准。
研究结果：
3.1 中空纤维膜的抗凝血活性：通过抗因子Xa活性评价DP和肝素的存在与活性。3.1.1 抗因子Xa活性：管式测定：PES/PVP BL-DP和PES/PVP BL-Hep分别为1.18 ± 0.52 IU·mL
?1和1.70 ± 0.71 IU·mL
?1，未修饰PES/PVP为0.19 ± 0.12 IU·mL
?1，仅BL-Hep升高具统计学显著性；这与肝素约180 IU·mg
?1、DP 11–19 IU·mg
?1的比活性差异有关。涂覆Elisio、FX1000和PES/PVP膜均较相应未修饰膜抗因子Xa活性更高，均值与共混膜相近，但共混膜样本变异性较大，涂层膜变异性较小，提示涂层功能化更可控且可适用于不同形貌和渗透性膜。3.1.2 抗因子Xa活性：微型透析器测定：BL-DP、BL-Hep和PES/PVP分别为1.80 ± 0.45、1.30 ± 0.62和1.11 ± 0.33 IU·mL
?1，差异不显著；Elisio CT-DP、FX1000 CT-DP和PES/PVP CT-DP显著高于相应未修饰膜，涂覆膜约2.0 IU·mL
?1，未修饰膜约1.0 IU·mL
?1；未修饰膜无抗凝分子，该活性应视为方法背景信号。共混膜变异性仍较高，说明涂层可在腔表面结合较一致量的DP或肝素，而共混将DP或肝素分布至整个膜壁，血液接触层定位较少且可变，故涂层在血液接触层提供更高DP和肝素可用性。
3.2 中空纤维膜的形貌：SEM显示自制HF膜内径约250 μm，呈不对称多孔结构，包括内侧海绵状选择性层及贯穿膜壁的指状大孔；商品化Elisio膜为海绵状多孔壁，内径约200 μm；形貌差异源于聚合物组成和纺丝条件不同。涂层后膜由白色略变为棕褐色，归因于polyDOPA沉积。
3.3 中空纤维膜的水通量与牛血清白蛋白筛分系数：PES/PVP BL-DP的K
UF为37 ± 4 mL·m
?2·h
?1·mmHg
?1，高于PES/PVP的29 ± 3 mL·m
?2·h
?1·mmHg
?1，自制膜属中通量HD膜；Elisio CT-DP的K
UF较Elisio由119 ± 3增至147 ± 3 mL·m
?2·h
?1·mmHg
?1，增加24%。自制膜选择性层厚度分别为1.7和2 μm，Elisio CT-DP和Elisio分别为1.0和0.5 μm；Elisio CT-DP选择性层因polyDOPA沉积增厚，但亲水性提高使K
UF升高。PES/PVP BL-DP与PES/PVP的BSA筛分系数相近（0.15 ± 0.01和0.14 ± 0.01）；Elisio CT-DP显著高于Elisio（0.19 ± 0.06和0.11 ± 0.01），可能与更高K
UF和污染减少有关，污染减少使选择性层上二次屏障较弱而BSA更易通过；未修饰Elisio在死端过滤中BSA筛分系数较高，代表较临床透析更严苛的白蛋白泄漏情形。整体表明共混和涂层未损害内选择性层传输性能。
3.4 中空纤维膜的表面表征：3.4.1 中空纤维膜的免疫染色：共聚焦显示PES/PVP BL-DP膜壁仅见微弱且不均匀信号；Elisio CT-DP在选择性层呈强信号并可延伸至膜壁。染色液仅经纤维腔注入，抗体主要染选择性层，长孵育也可扩散至膜壁。该结果与Kim et al.在共混平板和HF MMM中观察到明显DP免疫染色信号不同，可能与抗体特异性、膜形貌和显微镜技术差异有关；总体表明涂层可在血液接触层引入更高量DP。3.4.2 中空纤维膜的ATR-FTIR分析：PES/PVP BL-DP在3100–3500 cm
?1宽峰略增强，可能与O-H和N-H伸缩振动及氢键作用有关，但未见明确DP特征峰；Elisio CT-DP谱图提示polyDOPA存在，DP特征峰因与polyDOPA谱带重叠及表面DP量较低而无法清晰识别；3100–3500 cm
?1峰形和强度改变，1600–1700 cm
?1信号增强归因于polyDOPA芳环和亚胺官能团，1000–1500 cm
?1 PES相关谱带相对强度降低，说明polyDOPA层衰减PES信号；共混仅引起表面化学较小变化，涂层引起更明显谱图变化。3.4.3 中空纤维膜再循环后血浆中Danaparoid释放：血浆在微型透析器中再循环2小时后，PES/PVP BL-DP与PES/PVP凝血酶生成峰值相近（140 ± 10 nM和149 ± 6 nM），Elisio CT-DP低于Elisio但差异不显著（118 ± 44 nM和134 ± 42 nM），各膜滞后期约3.5 min；回收血浆相对抗因子Xa活性在BL-DP与PES/PVP间相近（16 ± 10%和15 ± 10%），Elisio CT-DP较Elisio仅轻微非显著升高（16 ± 7%和13 ± 4%）。结果表明DP主要保留于腔表面，未见明显释放入血浆，与Kim et al.报道平板MMM在37°C水中振荡24小时仅有限DP释放一致。
3.5 从人血中清除肌酐：人血体外透析显示，Elisio CT-DP与PES/PVP BL-DP总肌酐清除量相当（1166 ± 248和1066 ± 55 mg·m
?2），低于依据K
UF的预期，可能因纤维腔污染和/或血细胞沉积降低有效面积。Elisio CT-DP血压4小时内约升至1.2 bar，提示渐进性血细胞沉积；未修饰Elisio血压首小时内更快升至约2 bar，导致所有纤维腔血流阻塞并终止实验，说明DP可减少污染和细胞沉积。未修饰Elisio1小时总清除量（1135 ± 181 mg·m
?2）与Elisio CT-DP4小时相当，可能源于高血压下额外对流传输，首小时约10 mL液体由血转至透析液，而Elisio CT-DP4小时内血容量相对稳定。所有膜总肌酐清除量与文献中FX1000在类似条件下结果（1079 ± 194 mg·m
?2）同范围；Elisio CT-DP血液透析清除率（109 ± 34 mL·m
?2·min
?1）与厂商报道Nipro Elisio 19HX肌酐清除率145 mL·m
?2·min
?1同范围。整体表明DP可减少纤维腔污染和细胞沉积，同时保持毒素清除效率。
讨论与结论：该研究开发了含DP和肝素的HF膜以改善抗凝活性。结果表明，膜制备后涂层较共混更能在内侧血液接触表面提供高量DP并改善局部抗凝活性；抗因子Xa结果和涂层膜更强免疫染色信号均显示涂层在血液接触面提供更高且更可重复的抗凝活性。共混可能将DP分布至膜壁而非定位于血液接触表面，导致抗凝活性较低且变异较大。透析实验中，涂覆膜较未修饰膜显示更低污染和血细胞沉积，同时肌酐清除与共混膜及未修饰膜相当。未来工作应在真实临床条件下用人血开展HD研究，评估多种尿毒症毒素清除和白蛋白保留，并在动物研究前评估膜灭菌对性能的影响。
