抑制电压门控钾通道KV7.1的1,4-苯二氮?类构效关系及3-氟丙基衍生物活性研究

《Archiv der Pharmazie-Chemistry in Life Sciences》：Structure–Activity Relationships of 1,4-Benzodiazepines Inhibiting the Voltage-Gated Potassium Channel KV7.1

　　

K_V7.1拮抗剂在腹泻、反流性食管炎和低胰岛素血症治疗中具有潜力。1,4-苯二氮?类L768,673（(R)-1）是一种强效且选择性的K_V7.1通道阻断剂，其对K_V7.1离子通道的表观亲和力高于包括(R)-L3在内的其他K_V7.1调节剂。在本研究中，研究人员在L768,673（(R)-1）的两个位置进行系统修饰，并通过双电极电压钳（TEVC, two-electrode voltage-clamp）实验评估所得1,4-苯二氮?类的抑制作用。对伯胺rac-7和9进行酰化，得到酰胺8和10a–e。对仲内酰胺10a进行烷基化，得到叔内酰胺12a–c。带有大体积1-取代基的仲内酰胺10a–e和叔内酰胺12a,b不能抑制K_V7.1通道。然而，外消旋3-氟丙基衍生物12c与对映体纯先导化合物(R)-1活性相当，使12c成为开发¹⁸F标记正电子发射断层显像（PET, positron emission tomography）示踪剂的有前景起点。

电压门控钾通道K_V7.1（voltage-gated potassium channel 7.1, K_V7.1）在人体广泛表达，由4个KCNQ1-α亚基组装为同源四聚体；每个α亚基包含孔道结构域（PD, pore domain）和电压感受结构域（VSD, voltage-sensing domain），S1–S4构成VSD，S5和S6构成PD。K_V7.1功能丧失突变与长QT综合征1型（LQT1, long QT-syndrome 1）及Jervell and Lange Nielsen综合征（JLNS）相关；LQT1患者QT间期延长，易发生恶性心律失常和心源性猝死，JLNS患者除QT间期延长外还伴听力损失，激动剂如(R)-L3可能改善这些状况。另一方面，抑制K_V7.1也具有治疗潜力。结肠上皮细胞向管腔分泌Cl^?形成渗透梯度，是液体和粪便分泌的主要触发因素；K_V7.1/KCNE3复合物提供K⁺外流以对抗去极化、稳定膜电位并维持Cl^?分泌的电驱动力，因此抑制K_V7.1可限制液体和粪便分泌，K_V7.1抑制剂chromanol 293B可抑制霍乱毒素诱导的分泌电流。胃壁细胞H⁺/K⁺ ATPase分泌HCl需要K⁺经K_V7.1回收至胃腔，抑制K_V7.1可减少HCl分泌。K_V7.1过表达可限制小鼠胰腺β细胞系MIN6的胰岛素分泌，可能因K⁺外流增加导致超极化、降低电压依赖性Ca²⁺通道活性及Ca²⁺内流，而Ca²⁺内流对胰岛素分泌至关重要。因此，K_V7.1拮抗剂可用于腹泻、反流性食管炎和低胰岛素血症，并可作为研究胰岛素分泌的工具化合物。已有1,4-苯二氮?类L768,673（(R)-1）是强效、选择性K_V7.1阻断剂，其表观亲和力高于包括(R)-L3在内的其他K_V7.1调节剂；1,4-苯二氮?骨架抑制剂在更低浓度影响K_V7.1，L-735821的半数抑制浓度（IC₅₀, half-maximal inhibitory concentration）为173 nM，而(R)-L3的半数有效浓度（EC₅₀, half-maximal effective concentration）为4.2 μM，低浓度活性与更高亲和力相关，使L768,673（(R)-1）适合作为开发K_V7.1 PET示踪剂的先导化合物。基于此，研究人员对L768,673（(R)-1）进行构效关系（SAR, structure-activity relationship）研究，在1位和3位引入不同取代基并考虑3位构型，旨在获得可经TEVC评价的K_V7.1拮抗剂。

研究人员以L768,673（(R)-1）为先导，合成已知K_V7.1抑制剂及九个衍生物，并通过TEVC实验评价其对K_V7.1通道的抑制作用。结论表明，1位取代基对K_V7.1抑制是必需的；大体积1-取代基不被通道耐受；较小的3-氟丙基可保留强抑制活性。外消旋12c在500 nM时使通道活性变化?51%，与对映体纯(R)-1相当，且强于外消旋rac-1。由于12c含伯氟，其成为开发¹⁸F标记PET示踪剂的有前景起点。该研究明确了1,4-苯二氮?类K_V7.1拮抗剂的关键SAR位点，并为K_V7.1通道成像探针开发提供了候选骨架。

关键技术方法：采用化学合成与结构修饰获得目标1,4-苯二氮?类；用手性高效液相色谱（HPLC, high-performance liquid chromatography）分析rac-1与(R)-1的对映体比例；用双电极电压钳（TEVC, two-electrode voltage-clamp）在注射KCNQ1 cRNA的非洲爪蟾卵母细胞上记录全细胞电流，卵母细胞来源于EcoCyte Bioscience（Dortmund, Germany），以+40 mV脉冲后?120 mV尾电流峰值计算通道活性变化。

2.1 合成：研究人员以rac-7为关键中间体，经2-氨基二苯甲酮与2-溴乙酰溴反应、Delépine反应、水解与分子内环化、1位三氟乙基化、α位叠氮化及还原得到rac-7；手性拆分得到(R)-7；酰化得到rac-1、(R)-1和8；以3-氨基-1,4-苯二氮?9经HBTU偶联或3-硝基苯甲酰氯酰化得到10a–e；10a经NaH去质子化后与烷基对甲苯磺酸酯反应得到12a–c。该部分通过化学合成建立了先导化合物及1位、3位修饰衍生物的制备路线。

2.2 对映体纯度测定：通过手性HPLC在Daicel Chiralpak IM柱上分析rac-1和(R)-1，测得(R)-1/(S)-1比例为96.7%/3.3%。该部分通过手性色谱确认了(R)-1的对映体纯度，为后续活性比较提供依据。

2.3 K_V7.1通道活性TEVC测定：通过TEVC在500 nM测试浓度下评价化合物对K_V7.1通道的影响。(R)-1使通道活性变化?51±10%；去除1位三氟乙基得到的仲内酰胺10a为+12±2%，10b–e亦不能拮抗K_V7.1，提示1位取代基是阻断通道的必要条件。以10a为起点在1位引入大体积庚基（12a）和2-环己基乙基（12b），分别得到?4±8%和+1±4%，均无拮抗作用；较小的3-氟丙基衍生物12c为?51±5%，与(R)-1相当。rac-1在10 μM时为?48±6%，12c在500 nM即达?51±5%，活性强于rac-1。该部分通过TEVC功能实验得出：1位小体积氟丙基可保留强效K_V7.1抑制活性，12c是进一步开发PET示踪剂的候选。

讨论部分可归纳为：该SAR研究聚焦1,4-苯二氮?类K_V7.1拮抗剂的1位和3位取代及3位构型；活性数据表明1位取代基对K_V7.1抑制不可缺，大体积1位取代基导致活性丧失，而3-氟丙基在保持强效抑制的同时提供伯氟标记位点；12c虽为外消旋体，却与对映体纯(R)-1活性相当，并强于rac-1，提示其作为¹⁸F PET示踪剂起点的价值。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员合成了已知K_V7.1抑制剂L768,673（(R)-1）及九个衍生物，并在TEVC实验中评价其对K_V7.1通道的作用。结果显示，1位无取代基的仲内酰胺10a–e不抑制K_V7.1通道，表明1位取代基对K_V7.1抑制是必需的。1位大体积取代基（12a庚基、12b 2-环己基甲基）不被K_V7.1通道耐受。然而，较小的3-氟丙基部分耐受良好。外消旋混合物12c（500 nM时?51%）与对映体纯先导化合物(R)-1（500 nM时?51%）活性相当，甚至比外消旋体rac-1更强效。由于其伯氟，12c是开发适用于K_v7.1通道成像的氟-18标记PET示踪剂的有前景起点。