靶向ASC PYD结构域肽的生物信息学设计及其编码mRNA的初步细胞评估

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Bioinformatic design of ASC PYD-targeting peptides and preliminary cellular evaluation of their encoding mRNAs

　　

# 摘要

结构引导设计鉴定了两个靶向ASC PYD的候选肽段。ASC1和ASC2肽段对ASC PYD表现出更有利的预测结合自由能。mRNA递送使ASC靶向肽段的初步细胞评价成为可能。ASC1和ASC2改变了Jurkat T细胞中与细胞因子、氧化应激和细胞死亡相关的反应。ASC1表现出最有利的计算和细胞因子特征。

# 引言

炎症是一种基本的生理防御机制，保护宿主免受感染和组织损伤。尽管急性炎症通常是保护性且自限性的，但失调或持续的炎症反应会导致多种慢性疾病的发生发展，包括代谢性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病和神经退行性疾病。病理炎症的主要组成部分是炎症小体，这是一种胞质多蛋白信号平台，促进炎症性半胱天冬酶的激活以及强效促炎细胞因子的成熟和分泌，如白细胞介素-1β (IL-1β) 和白细胞介素-18 (IL-18)。在各种炎症小体复合物中，富含NOD、LRR和pyrin结构域的蛋白3 (NLRP3) 炎症小体因其涉及广泛的炎症和代谢性疾病而备受关注，使炎症小体信号成为治疗干预的重要靶标。

凋亡相关斑点状含CARD蛋白 (ASC) 是炎症小体信号传导中的关键接头蛋白。该蛋白由PYCARD基因编码，含有N端pyrin结构域 (PYD) 和C端半胱天冬酶募集结构域 (CARD)，分别介导与上游传感器蛋白和pro-caspase-1的同型相互作用。通过这些相互作用，ASC连接活化的炎症小体传感器与pro-caspase-1，并促进高阶炎症小体信号平台的组装。结构研究表明，ASC PYD结构域可通过同型PYD-PYD相互作用组装成纤维丝，而CARD介导的相互作用有助于ASC斑点的形成和炎症小体信号的放大。ASC PYD含有多个参与PYD-PYD组装的相互作用界面。结构分析已鉴定出ASC PYD纤维丝中三个主要界面，分别称为界面I、II和III。这些界面提供不同的分子接触，稳定相邻ASC PYD结构域之间的相互作用，其中界面I在ASC PYD-PYD相互作用和ASC寡聚化中起重要作用。因此，靶向ASC PYD相互作用界面而非单一上游传感器，为在接头蛋白水平调控炎症小体相关信号提供了一种策略。

肽段作为靶向蛋白-蛋白相互作用的候选分子特别具有吸引力，因为它们的大小和化学多样性使其能够识别相对较广的分子表面，而这些表面对于传统小分子可能难以靶向。结构引导的计算方法可以进一步促进肽段工程，允许在实验测试之前识别相互作用残基并评估序列修饰。分子动力学 (MD) 模拟可以提供关于构象行为和结构稳定性的见解，而计算结合能方法可用于比较候选复合物的相对能量特征。

使用肽段靶向炎症小体复合物中的蛋白-蛋白相互作用已成为一种有前景的策略。Su?jan等人 (2020) 评估了对应于NLRP3和ASC区域的肽段，并鉴定出一个源自ASC PYD、对应于H2–H3区域的肽段，该肽段通过与NLRP3 PYD结合抑制NLRP3炎症小体激活。该肽段减少IL-1β释放和caspase-1激活，并在其实验系统中表现出对NLRP3炎症小体相对于AIM2和NLRC4炎症小体的选择性。重要的是，该研究证明源自炎症小体组分的短肽段可以干扰特定的PYD介导相互作用并调控炎症小体活性。类似地，Pal等人 (2019) 表明，靶向ASC PYD的细胞通透性订书肽段可以干扰ASC相关的炎症小体激活并减少促炎细胞因子的产生。这些研究为基于肽段的炎症小体相关蛋白-蛋白相互作用调控的可行性提供了实验支持。计算方法进一步扩展了理性肽段设计的可能性。Ahmad等人 (2023) 开发了一种计算策略，用于从头设计NLRP3抑制肽段，结合基于循环神经网络的序列生成与分子动力学衍生的结构和物理化学特征。实验测试的肽段表现出抑制NLRP3介导的IL-1β和IL-18反应，突显了计算方法加速炎症小体靶向肽段发现的潜力。Zulfat等人 (2026) 采用计算机模拟策略鉴定肽段抑制剂，设计用于通过阻断NLRP3-ASC PYD-PYD相互作用来破坏NLRP3炎症小体组装。他们的工作进一步支持了使用计算诱变和结构分析设计干扰炎症小体相关PYD相互作用的肽段。

最近，Mandal等人 (2025) 报告了一种密切相关的基础结构引导肽段设计策略，基于源自天然PYD的序列。他们设计了源自NLRP3和ASC PYD的肽段，并证明天然肽段的策略性突变可产生对ASC PYD具有纳摩尔亲和力的衍生物，以及对NLRP3炎症小体组装、IL-1β释放和Caspase-1成熟的抑制活性。

总之，这些研究表明，天然或天然衍生的肽段序列可以为理性优化提供有用的结构模板，且靶向序列修饰可显著改变其与炎症小体组分的相互作用。

然而，这一特定靶向策略在现有方法中仍然独特。先前的研究主要集中在抑制NLRP3本身、破坏NLRP3-ASC相互作用或使用ASC衍生的肽段靶向NLRP3 PYD。相比之下，使用ASC衍生的结构模板直接结构引导靶向ASC PYD-PYD界面表面受到的关注相对有限。此外，尽管肽段疗法具有潜力，但其直接给药可能受到较差的细胞摄取、蛋白酶解降解和有限的细胞内稳定性等限制。相比之下，基于mRNA的方法利用递送的mRNA作为细胞内翻译编码产物的瞬时模板，提供了在细胞内产生生物活性分子的替代手段。近年来，mRNA序列工程和递送技术的进展扩展了基于mRNA策略的潜在应用，包括蛋白替代、细胞因子表达、细胞治疗和其他治疗应用。然而，与mRNA稳定性、递送效率、安全性和固有免疫原性相关的挑战仍然是重要的考量因素。

因此，将结构引导的肽段工程与mRNA介导的细胞内递送相结合，为评估设计用于靶向细胞内蛋白-蛋白相互作用的肽段候选物提供了一种互补方法，无需直接给药合成肽段。

值得注意的是，计算设计的ASC靶向肽段候选物与基于mRNA的细胞内递送策略的结合似乎受到的关注有限。靶向ASC本身的治疗意义得到了研究表明ASC寡聚化药理抑制可干扰ASC斑点形成并抑制多种ASC依赖性炎症小体的支持。

在本研究中，我们使用结构引导的计算方法设计了两个靶向人ASC PYD界面I区域的短候选肽段。设计的肽段序列随后被编码到DNA构建体中，体外转录为mRNA，并转染至Jurkat T细胞中，以在其接受LPS/SiO?刺激后初步评估其细胞反应的影响。这一整合计算和实验的策略用于评估ASC PYD靶向候选肽段并确定用于进一步机制研究的候选物。

# 各部分片段

## 靶标选择和结构分析

ASC (凋亡相关斑点状含CARD蛋白) 接头蛋白的pyrin结构域 (PYD) 被选为结构引导肽段设计的分子靶标，靶向ASC PYD相互作用表面。ASC PYD纤维丝的冷冻电镜结构 (PDB ID: 3J63)，代表多聚体组装，作为主要结构模板，用于鉴定涉及ASC纤维丝组装的PYD-PYD相互作用表面。ASC PYD纤维丝的结构分析

## 合成编码ASC1和ASC2肽段的DNA序列

为生成编码ASC1和ASC2肽段的DNA序列，最终肽段序列被逆转录为DNA序列，并使用GenScript在线服务器进行密码子优化以适用于人系统表达。所得DNA序列随后进行商业合成。

## 基因克隆和重组质粒制备

编码ASC1和ASC2肽段的密码子优化DNA序列通过聚合酶链式反应 (PCR) 扩增，使用设计引入BamHI和XhoI限制性位点的引物进行定向克隆

## 结构引导的ASC PYD靶向候选肽段设计与优化

采用结构引导的肽段设计策略开发靶向ASC PYD-PYD相互作用界面的肽段候选物。对人ASC PYD纤维丝 (PDB ID: 3J63) 的结构分析，结合界面I在ASC寡聚化中确立的重要性，促使选择一个位于界面I对面并互补的α螺旋片段作为肽段设计的结构模板 (图2A–C)。该片段包含Leu20–Pro31残基，形成

# 讨论

在本研究中，我们开发了一种整合计算和实验的策略，以研究靶向ASC蛋白PYD结构域的短肽段候选物。利用ASC PYD纤维丝的结构引导分析鉴定了一个靶向界面I区域的ASC衍生α螺旋模板，随后进行序列优化和对结果候选物的计算评估。设计的肽段序列随后被编码在DNA构建体中，转录为

# 局限性和未来方向

应考虑以下几项局限性：

首先，Jurkat T细胞被用作实验模型。尽管该模型为肽段效应的初步评估提供了实用的细胞系统，但它不是研究炎症小体的经典巨噬细胞或原代髓系模型。在THP-1衍生巨噬细胞、原代单核细胞/巨噬细胞以及最终体内模型中的验证将是建立生理相关性所必需的。

其次，本研究未直接

# 结论

总之，本研究提出了一种整合策略（结合计算和实验方法），用于设计并初步细胞评估靶向ASC PYD的肽段候选物。ASC PYD纤维丝的结构分析使得可以选择与界面I区域互补的ASC衍生α螺旋模板，随后进行结构引导的序列优化和计算评估。两个设计的肽段均表现出更有利的预测结合

# CRediT作者贡献声明

Mahsa Karimian：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，调查，资金获取，数据管理。Ali Es-haghi：写作 – 审阅与编辑。Zahra Kianmehr：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，验证，调查，数据管理。Maryam Ghobeh：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，数据管理。

# 利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文章所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

# 资金

本研究未获得公共、商业或非营利部门资助机构的任何特定拨款。

# 竞争利益声明

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

Mahsa Karimian | Zahra Kianmehr | Maryam Ghobeh | Ali Es-haghi