《Transboundary and Emerging Diseases》：Within-Host Evolution of Foot-and-Mouth Disease Virus From Persistently Infected Cattle and Buffaloes in Vietnam
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口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）通过维持感染超过检出后21天的携带动物而实现地方性持续存在。研究人员利用非暴发条件下的纵向口咽液采样（间隔3–4个月），刻画了越南北部持续感染牛（n=168）和水牛（n=16）中的
口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）通过维持感染超过检出后21天的携带动物而实现地方性持续存在。研究人员利用非暴发条件下的纵向口咽液采样（间隔3–4个月），刻画了越南北部持续感染牛（n=168）和水牛（n=16）中的宿主内FMDV进化特征。动物持续保持实时逆转录聚合酶链反应（rRT-PCR）阳性且无临床口蹄疫症状。持续感染被定义为各采样时间点间VP1核苷酸差异<2%；系列感染则通过连续样本间差异>5%予以识别。在来自38头持续感染宿主（persistently infected hosts，PIHs）的120条序列中，13.3%的表观携带者（rRT-PCR阳性>21天）实际上是由不同毒株引起的系列感染。这一发现强调，在多样性较高的环境中估算携带者流行率时，除口咽液（oropharyngeal fluid，OPF）阳性外，还需进行序列确认。真正的持续感染（33头动物）表现出快速的VP1进化（0.081突变/nt位点/年），其中多样性选择在VP1和VP3衣壳区域最强。O型血清型PIH的VP3突变率高于A型。研究中还检测到血清型间重组，与携带动物充当病毒混合容器的观点一致。这些现场数据证实，FMDV携带者在自然条件下存在高进化速率和重组现象，将实验性超感染研究结果扩展至地方性流行系统。研究结果支持在资源有限地区开展有针对性的PIH检测和管理，以阻断FMDV的持续存在与进化。
一、研究背景与目的
口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）是一种正义单链RNA病毒，具有7种血清型（O、A、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3和Asia 1），其基因组约含8000个核苷酸，其中P1区域约2000个核苷酸，编码VP1至VP4衣壳蛋白，因变异速率快且与血清型分类和免疫识别密切相关，常被用作流行病学研究的靶标。流行病学理论认为，高传染性病原体在易感宿主耗尽后应趋于灭绝，但持续感染宿主（persistently infected hosts，PIHs）——即携带者——可在不表现临床疾病的情况下长期携带病原体，为病毒提供逃避灭绝的途径。非洲水牛（Syncerus caffer）可被FMDV持续感染长达5年，家养牛的持续感染也被证实至少可达28个月，然而从未有研究证明持续感染牛可将病毒自然传播给易感动物。尽管携带牛的存在已深刻影响FMDV防控政策，但其在传播生态与病毒进化中的具体作用至今仍不明确。自20世纪50年代确认FMDV携带者以来，野外条件下关于宿主内病毒分子进化的研究仅有少数报道，且持续感染过程中P1区域突变与携带状态的关系在不同研究中并不一致。为此，研究人员利用越南2017至2019年间的纵向现场样本，对A型和O型FMDV开展研究，旨在：（1）鉴定与持续感染相关的特异性氨基酸变化位点；（2）估算宿主内VP1、P1区域及全基因组的替代率；（3）通过系统发育关系评估携带动物在病毒群体维持和疫情暴发中的潜在流行病学意义。
二、研究方法概述
研究人员于2017至2019年间，在越南8个省份对272头牛科动物（161头牛、69头水牛、42头未指明物种）进行纵向采样，每3至4个月采集口咽液（oropharyngeal fluid，OPF）。样本先经qRT-PCR初筛，阳性样本经LFBK-αvβ6细胞进行病毒分离，随后采用Illumina NextSeq平台对病毒分离上清液进行下一代测序（next-generation sequencing，NGS）。依据P1区序列差异，将感染状态分类为持续感染（连续样本间差异<2%）或系列感染（差异>5%）。采用SLAC、FUBAR和FEL三种方法进行dN/dS分析以检测正选择位点；利用BEAST v1.10.4进行系统动力学分析，以离散性状分析（discrete trait analysis，DTA）结合贝叶斯随机搜索变量选择（Bayesian stochastic search variable selection，BSSVS）评估各感染状态间的转换，采用GTR+I+G替代模型、对数正态非相关松弛分子钟及贝叶斯Skygrid协同模型，马尔可夫链蒙特卡洛迭代充分收敛。
三、研究结果
3.1 进化模式（Evolutionary Patterns）
通过对同一PIH内连续时间点序列的配对比较，研究人员估算出宿主内平均替代率在不同基因组区域间存在差异：VP1区域最高，为0.081突变/nt位点/年；编码序列（coding DNA sequence，CDS）为0.069；P1其余部分（不含VP1）为0.060。这些数值高于种群水平系统动力学分析所得估计值（A型为0.020，O型为0.015），但仍在同一数量级内。种群水平分析所用序列包括越南临床暴发和屠宰场来源的A型（n=122）和O型（n=96）横断面样本。
3.2 携带者样本中的非同义突变（Nonsynonymous Mutations in Samples From Carriers）
P1区域配对比较显示，A型10对持续感染配对序列中，4对在VP3位点438发生非同义改变，5对在VP1位点623发生改变；O型35对配对序列中，8对在VP3位点378出现非同义改变，另有多个位点（VP1位点477、VP2位点218、VP3位点376）各在4个配对中出现变化。多项dN/dS分析表明，这些位点中相当一部分在宿主内及种群水平均受到正选择压力。全CDS分析中，A型6对配对样本中有2对在多个位点（420、824、1557、1571、2020、2072）发生突变，O型9对中有3对在位点921发生突变。将正选择位点与已报道抗原区域比对后发现，O型正选择位点568和569对应VP1 T辅助表位ETQIQRRQHTDVSFIMDRFV（多聚蛋白第769至788位），A型位点696对应VP1重叠B细胞表位区（第886至903和第892至919位），O型VP3位点379对应T辅助表位PFGHLTKLELPTDHH（第379至393位）。然而，多数正选择位点位于已报道抗原区域之外。
3.2.1 离散性状分析（DTA）
研究人员在BEAST中对A型和O型序列分别进行DTA，将样本划分为暴发（outbreak）、持续感染（persistent）和未确定（undetermined）三种状态；纵向样本的首次检出时间点因无法确定感染持续时长而被保守地归类为未确定。A型中仅从未确定状态向持续感染和暴发状态的转换获得统计支持（贝叶斯因子>100）。O型中，从未确定向暴发和持续感染、从暴发向未确定、以及从持续感染向未确定的转换均有统计学支持（贝叶斯因子>3，估计转换次数介于5至20次）。其中持续感染状态向未确定状态的转换提示，O型FMDV可能在携带动物的持续感染期发生了向前传播。
四、讨论与结论
本研究证实，携带动物体内的FMDV并非处于静止状态，病毒进化贯穿持续感染全程。宿主内替代率（0.06–0.08替代/位点/年）数值上高于种群水平（0.01–0.02替代/位点/年），且VP1始终比其他基因组区域进化更快，说明免疫压力是驱动FMDV跨生物尺度进化的关键因素。血清型间存在差异：A型变化集中在VP1，O型变化集中于VP3，推测不同衣壳蛋白在结构约束和免疫可及性上存在差异。与Ramirez-Carvajal等人报道的以纯化选择为主且无明显抗原选择模式的结果相比，本研究中多数正选择位点位于已知抗原区域之外，提示仅凭序列分析无法判定这些变异是否改变抗原性或导致免疫逃逸，仍需抗体结合和T细胞识别等功能试验加以验证。
在传播潜力方面，采用保守分类准则的DTA仍检测到少数从O型持续感染状态向未确定状态的转换事件，提供了野外条件下携带动物可能在持续感染阶段实现向前传播的间接统计支持，但尚不能替代直接流行病学证据。此外，在38头表观携带者中有5头牛实际为系列感染，即约13.3%基于rRT-PCR阳性超过21天而界定的“携带者”实为不同亚系毒株的连续感染，提示在高病毒多样性地区仅凭分子检测阳性可能高估真正携带者比例，序列确认不可或缺。系列感染的存在增加了共感染机会，可能为病毒重组提供条件。本研究的局限性包括：3至4个月的采样间隔可能遗漏中间变异，共识序列无法全面反映宿主内多样性，病毒分离过程可能引入培养适应变异；但纵向、暴发和屠宰场样本均采用相同处理流程，故培养相关选择不太可能造成群体间的系统性偏差。总之，这些现场数据证实了FMDV携带者在自然条件下的高进化速率和重组现象，将实验性超感染研究结论扩展至地方性流行体系，支持在资源有限地区开展有针对性的PIH检测与管理，以阻断FMDV的持续存在与进化。
