半乳糖凝集素-3通过调控小胶质细胞对PrPSc的摄取在朊病毒病中发挥保护作用

《Brain Pathology》：Protective role of Galectin-3 in prion disease through regulation of microglial PrPSc uptake

　　

小胶质细胞构成抵御朊病毒感染的主要固有免疫防御机制；然而，调控疾病进程中小胶质细胞反应的分子通路仍未完全阐明。半乳糖凝集素-3（Galectin-3，Gal3）是一种β-半乳糖苷结合凝集素，在多种神经退行性疾病中与反应性小胶质细胞相关，已被证实参与吞噬作用、炎症信号传导及溶酶体稳态维持。本研究利用朊病毒感染小鼠模型探讨了Gal3在朊病毒病发病机制中的作用。Gal3在健康脑组织中表达检测不到，但在临床前晚期开始上调，并随疾病进展逐渐增加。Gal3主要定位于IBA1阳性反应性小胶质细胞的亚群中，尤其在丘脑区域，且与稳态小胶质细胞标志物P2Y12和TMEM119的表达呈负相关，与获得反应性表型一致。在疾病终末期，参与神经元包裹的小胶质细胞表现出升高的Gal3表达。Gal3组成性缺失显著加速临床疾病进展，但不改变总PrPSc蓄积、反应性胶质增生、神经元包裹或总体小胶质细胞和星形胶质细胞活化。然而，Gal3缺失显著减少小胶质细胞对PrPSc的摄取，导致细胞内与细胞外PrPSc比值降低，支持Gal3在朊病毒吞噬性隔离中的作用。相反，Gal3缺失并不损害溶酶体活性、溶酶体膜完整性或参与溶酶体修复通路基因的表达。同样，在髓系细胞中选择性抑制自噬仅对疾病进展产生轻微影响。综上所述，这些发现将Gal3鉴定为反应性小胶质细胞的敏感标志物，其有助于小胶质细胞对PrPSc的摄取，并在朊病毒病进展过程中发挥保护作用。

论文解读

一、研究背景与科学问题

朊病毒病（prion diseases），又称传染性海绵状脑病（transmissible spongiform encephalopathies，TSEs），是一类致死性传染性神经退行性疾病，可影响人类和动物。朊病毒病由朊病毒（prions，即PrP^Sc）引起，PrP^Sc是宿主编码的细胞朊蛋白（PrP^C）的错误折叠和聚集形式。疾病进展由PrP^C向富含β-折叠的PrP^Sc构象体的自我增殖性转化驱动，导致朊病毒在中枢神经系统（CNS）中蓄积和扩散。目前尚无有效疗法。

小胶质细胞是CNS的主要固有免疫细胞，持续监测脑微环境并介导受损细胞和蛋白聚集物的清除。大量证据支持小胶质细胞构成抵御朊病毒感染的主要宿主防御机制。在朊病毒接种前或疾病早期耗竭小胶质细胞可加速疾病进展并缩短生存时间。然而，也有研究表明小胶质细胞在疾病后期可能发挥有害作用。在临床前阶段部分抑制小胶质细胞增殖和反应性可延迟神经症状发作并延长生存期。这些发现支持小胶质细胞可能随神经退行性变进展从保护性表型转变为致病性表型的观点。

Galectin-3（Gal3）是一种多功能β-半乳糖苷结合凝集素，参与小胶质细胞活化、固有免疫信号传导和CNS组织重塑。Gal3优先识别含β-半乳糖苷的聚糖，对缺乏末端唾液酸化的分支复合型N-聚糖具有高亲和力。生理条件下Gal3在CNS中表达较低，但损伤、感染和蛋白质错误折叠可触发Gal3的强烈上调，尤其在活化的小胶质细胞中。Gal3兼具细胞内和细胞外功能，可作为调理素发挥作用。通过结合TLR4和整合素，Gal3放大促炎信号级联并促进小胶质细胞向阿米巴样吞噬表型转化。在细胞内，Gal3参与溶酶体完整性维持，在溶酶体膜损伤时迅速聚集于破裂溶酶体上，招募ESCRT机制和自噬通路成分协调膜修复和溶酶体自噬。

在包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化和朊病毒病等多种神经退行性疾病中，Gal3在反应性小胶质细胞中持续上调。单细胞转录组研究已将Gal3鉴定为疾病相关小胶质细胞（DAM）晚期阶段的特征标志物。然而，Gal3上调的功能后果具有情境依赖性。在AD的5XFAD小鼠模型中，Gal3缺失减少了淀粉样蛋白-β负荷并改善了认知功能；Gal3耗竭还抑制了tau传播、神经炎症及相关功能损伤。在亨廷顿病模型中，Gal3缺失减弱了炎症反应、减少了亨廷顿蛋白聚集、改善了运动功能并延长了生存期。这些发现提示Gal3可能促进神经退行性病理过程。

在朊病毒病中，Gal3在受影响的脑区强烈上调，主要定位于髓系细胞包括反应性小胶质细胞。一项早期研究报告Gal3缺陷小鼠感染139A朊病毒株后生存期显著延长，尽管PrP^Sc蓄积或胶质活化无 detectable 变化。这一发现提示Gal3可能是高度选择性的疾病修饰或治疗靶点。然而，这些初步发现尚未得到后续机制研究的跟进。研究人员因此使用SSLOW朊病毒株独立重新检验了Gal3在朊病毒病中的作用。SSLOW株具有最短的潜伏期，并引发特别显著和广泛的神经炎症，为检查小胶质细胞活化和PrP^Sc处理提供了稳健的实验系统。

二、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：使用SSLOW朊病毒株经颅内（i.c.）或腹腔（i.p.）途径接种C57BL/6J小鼠和Gal3敲除（KO）小鼠（品系#006338，Jackson Laboratory）以及Becn1条件敲除（Becn1^flox/floxLyz2^Cre/Cre）小鼠；采用免疫荧光和DAB免疫组织化学检测Gal3、IBA1、PrP^Sc、P2Y12、TMEM119、Vim、NeuN、LAMP1、组织蛋白酶D（cathepsin D）、GPNMB等蛋白表达；使用共聚焦显微镜和三维图像重建分析小胶质细胞-神经元相互作用；Western blot检测PrP^Sc、Gal3、CD11b、IFITM3、Vim、LAMP1和组织蛋白酶D等蛋白水平；RT-qPCR检测神经炎症和溶酶体修复相关基因表达；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）验证Gal3与PrP^Sc的结合。

三、研究结果

3.1 疾病进展期间Gal3在髓系细胞亚群中表达上调

研究人员通过Western blot分析发现，Gal3在健康脑中检测不到，在92天感染后（dpi）出现轻度上调，在122 dpi（临床发作期）出现显著增加，并随疾病进展持续升高。免疫组化显示PrP^Sc蓄积、小胶质细胞增生和Gal3免疫反应性之间存在区域相关性。Gal3⁺细胞广泛分布于所有受朊病毒影响的脑区，在丘脑（受影响最严重的脑区）尤为突出。P2Y12或CD11b缺失可进一步增加朊病毒感染小鼠的Gal3表达。共免疫染色显示Gal3由IBA1⁺髓系细胞亚群表达，部分与Vim⁺反应性星形胶质细胞共定位，尤其在纹状体中。

3.2 Gal3在向反应状态转变的驻留小胶质细胞中上调

共聚焦成像显示Gal3主要呈细胞内定位。Gal3⁺细胞大多仅表达微量TMEM119和P2Y12（驻留小胶质细胞标志物），而尚未获得反应表型的TMEM119⁺或P2Y12⁺细胞几乎不表达Gal3。同时存在同时表达Gal3和TMEM119/P2Y12的中间态细胞，提示小胶质细胞向反应性转化的过渡状态。

3.3 包裹神经元的小胶质细胞表达Gal3

在临床发作期，包裹和非包裹小胶质细胞之间的Gal3表达无差异。但在疾病终末期，参与神经元体-体相互作用的小胶质细胞Gal3水平显著高于非包裹小胶质细胞。Gal3⁺小胶质细胞群体中参与神经元包裹的比例倾向于高于Gal3^?群体，但未达到统计学显著。这些观察提示Gal3并非小胶质细胞初始锚定神经元所必需，但可能在微胶质-神经元接触后被诱导。

3.4 Gal3缺失加速朊病毒病进展

Gal3 KO小鼠和野生型（WT）小鼠的临床发作时间相似，但发作后疾病进展显著加速（Gal3 KO生存时间119.9±6.2天 vs WT 125.4±3.1天），两性均如此。总PrP^Sc蓄积在两种基因型之间无差异。IFITM3、CD11b（反应性小胶质细胞标志物）和Vim（星形胶质细胞反应性标志物）表达均无基因型依赖性差异。RT-qPCR显示Tlr4、Ccl2、CD68和GPNMB在感染小鼠中显著上调，但Gal3 KO和WT之间无显著差异。

3.5 Gal3缺失不改变小胶质细胞对神经元的包裹

神经元和小胶质细胞密度在Gal3 KO和WT小鼠之间无差异。两种基因型均观察到广泛的神经元包裹。神经元与小胶质细胞发生体-体接触的百分比以及参与包裹的小胶质细胞百分比在两组之间相当。

3.6 Gal3缺失减少小胶质细胞对PrP^Sc的摄取

在两种基因型中均可检测到与小胶质细胞相关的细胞内PrP^Sc斑点。总PrP^Sc斑点（细胞外和细胞内合计）在基因型之间无差异，与Western blot结果一致。然而，Gal3 KO小鼠中小胶质细胞相关PrP^Sc斑点的比例显著降低，导致细胞内与细胞外PrP^Sc比值显著降低。在单个细胞水平，PrP^Sc在Gal3⁺和Gal3^?小胶质细胞中均可检测到，但Gal3⁺小胶质细胞中PrP^Sc阳性细胞比例倾向于更高。免疫共沉淀实验证实Gal3可与PrP^Sc结合。此外，在丘脑区域，约20%的IBA1⁺细胞为Gal3⁺/GPNMB^?，约10%为Gal3^?/GPNMB⁺，24%为Gal3⁺/GPNMB⁺，表明两个群体存在部分重叠。

3.7 Gal3缺失不损害溶酶体功能

Western blot分析显示LAMP1和组织蛋白酶D表达在Gal3 KO和WT之间无差异。pro-组织蛋白酶D与成熟组织蛋白酶D的比值（溶酶体加工效率指标）在两种基因型之间也无变化。免疫荧光定量证实小胶质细胞内LAMP1和组织蛋白酶D水平相当，组织蛋白酶D与LAMP1的共定位（溶酶体膜破裂指标）无基因型差异。溶酶体功能、感应和修复相关基因（Alix、Tsg101、Trim16）的表达在基因型之间也无变化。

3.8 小胶质细胞自噬缺陷不改变疾病进展

SSLOW感染的Becn1条件敲除（cKO）小鼠相对于对照Lyz2^Cre/Cre小鼠表现出轻微的潜伏期缩短，但未达到统计学显著。两组PrP^Sc蓄积相当。Becn1 cKO小鼠中小胶质细胞相关PrP^Sc有减少趋势但无统计学差异。CD11b、Vim、总LAMP1、Gal3、组织蛋白酶D及pro/成熟组织蛋白酶D比值在两组之间无差异。值得注意的是，Becn1 cKO小鼠中小胶质细胞LAMP1（较神经元LAMP1糖基化更重，可通过Western blot区分）相对于总LAMP1增加，提示小胶质细胞内溶酶体蓄积，与溶酶体自噬受损一致。

四、讨论与结论

本研究表明Gal3在朊病毒病中的上调始于临床前晚期，并随疾病进展逐渐增加。Gal3与稳态小胶质细胞标志物P2Y12和TMEM119在单个细胞水平呈负相关，提示Gal3与晚期反应性小胶质细胞表型相关。GPNMB⁺和Gal3⁺小胶质细胞群体在丘脑存在显著重叠。

与预期相反，Gal3缺失对神经元包裹无影响，尽管显著减少了小胶质细胞对PrP^Sc的摄取。这提供了功能证据表明神经元包裹和吞噬作用是机制上不同的过程。神经元包裹并非吞噬作用的前体阶段，而是独立于Gal3介导吞噬机制的特化小胶质细胞-神经元相互作用。

Gal3缺失减少PrP^Sc摄取并加速疾病进展。免疫共沉淀证实Gal3结合PrP^Sc。Gal3对缺乏末端唾液酸化的分支N-聚糖具有高亲和力。PrP^C和PrP^Sc均携带多达两个分支N-连接聚糖，每个聚糖含有多达五个唾液酸残基。脑中约40%的N-连接聚糖分支被唾液酸化，留下大量未封端的β-半乳糖残基暴露。SSLOW株优先招募低唾液酸化PrP^C亚型，富含未封端β-半乳糖残基。这些发现为Gal3通过识别未封端β-半乳糖聚糖参与小胶质细胞PrP^Sc摄取提供了实验证据。

小胶质细胞对PrP^Sc的摄取不一定降低脑中总PrP^Sc水平；小胶质细胞可能作为细胞汇（cellular sink），隔离细胞外朊病毒，限制其与易感神经元相互作用。因此，总PrP^Sc蓄积无差异并不削弱细胞摄取改变的意义。Gal3缺陷小鼠疾病加速伴随小胶质细胞与PrP^Sc关联减少，支持小胶质细胞隔离PrP^Sc是生物学上有意义的宿主防御机制。

本研究结果与Mok等人的早期报告相反，后者观察到Gal3缺陷延长了139A株感染小鼠的生存期。本研究显示Gal3缺陷加速而非延缓疾病进展，并伴随小胶质细胞PrP^Sc摄取减少。这些发现不支持在朊病毒病中治疗性抑制Gal3通路，而是支持Gal3介导的小胶质细胞PrP^Sc隔离具有保护作用。

在体内条件下，Gal3并非维持溶酶体完整性所必需。Gal3在溶酶体修复中的作用（先前在培养细胞中描述）在体内可能不同，存在额外的补偿机制。抑制小胶质细胞自噬仅对疾病进展产生轻微非显著影响。在缺乏高效PrP^Sc降解的情况下，小胶质细胞增殖可能增加大脑隔离PrP^Sc的总体能力。

研究结论：Gal3是反应性小胶质细胞的敏感标志物，通过促进小胶质细胞对PrP^Sc的吞噬性摄取发挥保护作用。Gal3缺失减少PrP^Sc摄取并加速疾病进展，但不改变总PrP^Sc蓄积、反应性胶质增生、神经元包裹或溶酶体功能。这些发现支持Gal3介导的小胶质细胞PrP^Sc隔离作为朊病毒病中生物学上有意义的宿主防御机制，为理解小胶质细胞在朊病毒病中的保护性功能提供了新的机制见解。