治疗性单克隆抗体强制降解研究产物的毛细管凝胶电泳分析

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Capillary gel electrophoresis analysis of the forced degradation study products of a therapeutic monoclonal antibody

　　摘要要点：• 这是关于在daratumumab（达雷木尤单抗）强制降解研究中首次采用毛细管电泳技术的首报。• SDS-CGE可对应力条件诱导的mAb（单克隆抗体）降解进行快速、高分辨率的分析。• 多种应力因素可诱导各异的分子水平mAb变化，均可通过SDS-CGE检出。引言治疗性蛋白质，尤其是单克隆抗体（mAbs），因其高靶标特异性和治疗疗效，构成了生物制药中重要的一类[1]、[2]。然而，其结构复杂性使其在制造、配方、储存、运输和使用过程中易受理化应力影响[3]。因此，在生物制药开发过程中，强制降解研究被常规用于评估产品稳定性、识别对应力敏感的质量属性，并支持开发适当的控制策略[4]。在过程分析与质量控制环境中，快速、稳健且尽可能自动化的分析方法对于监测产品完整性和一致性尤为有价值[5]。mAbs的应力诱导不稳定可能涉及物理变化，如 unfolding（去折叠）、聚集或沉淀，以及化学降解途径，包括氧化、脱酰胺、水解和二硫键重排[6]、[7]。因此，强制降解实验通常在多种理化条件下进行，以获取治疗性蛋白质稳定性特征互补的信息[8]。由于mAb降解可能涉及若干结构上互不相同的过程，其分析表征通常需要互补技术。电泳方法已成功应用于蛋白质和多肽表征，包括与质谱检测联用的基于CE的多肽图谱策略[9]；而在更广泛的生物制药开发流程中，则综合使用各类色谱、电泳、光谱、热分析和质谱技术来评估蛋白质质量与稳定性[10]。CE–MS的最新发展进一步拓展了CE在高分辨率蛋白质与多肽表征方面的潜力[11]。在基于CE的方法中，SDS-CGE被广泛用于单克隆抗体及其片段的基于大小的表征[12]、[13]、[14]、[15]。该自动化技术结合了相对较短的分析时间与高分辨率分离，特别适用于监测完整抗体及低分子量降解产物分子大小分布的变化[16]。商用SDS-CGE系统在约10–225 kDa的分子量范围内通常较为有效，因此非常适合用于抗体片段的检测[13]。然而，这一分析窗口也构成了一项重要局限，因为高分子量聚集体可能无法被检出，且仅靠迁移行为也无法对未知降解产物给出明确的结构鉴定。因此，SDS-CGE应被视为一种快速筛查方法及互补的稳定性指示技术，而非用于表征所有降解途径的综合性方法。本研究中选择daratumumab（达雷木尤单抗，一种用于治疗多发性骨髓瘤的临床相关治疗性单克隆抗体）作为研究对象。此前的工作已建立了一套详细的daratumumab分析表征流程[17]，其在临床相关操作条件下的使用稳定性也已得到考察[18]。但据我们所知，其在一系列广泛且系统施加的强制应力条件下，其分子大小降解行为尚未通过SDS-CGE进行系统比较表征。因此，本研究将daratumumab作为具有药剂学相关性的模型体系，用于考察不同的理化应力是否会产生可区分的电泳降解模式，并确定其中哪些分子水平变化可被SDS-CGE快速检出。本研究的目的在于，将SDS-CGE作为新型分析技术引入，而是确立daratumumab在酸性、碱性、氧化、机械、热、冻融和紫外应力条件下的应力依赖型降解比较图谱，同时评估SDS-CGE用于此目的的实用性分析能力及其局限。未知降解片段的确证性结构鉴定将需要与质谱联用SDS-CGE，这一方法最近已在多肽和蛋白质分析中得到验证[19]。部分摘要化学品乙酸、乙酸铵、硼酸、Tris、乙二胺四乙酸二钠（EDTA.Na2）、甘油、十二烷基硫酸钠（SDS）、2-巯基乙醇、盐酸和氢氧化钠购自VWR（美国宾夕法尼亚州Radnor）。碘乙酰胺、溶菌酶和葡聚糖聚合物（2 MDa）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。达雷木尤单抗（Darzalex?，Janssen Biotech，美国宾夕法尼亚州Horsham），一种用于治疗多发性骨髓瘤的单克隆抗体，作为商品无菌输液获得。结果与讨论本研究通过SDS-CGE系统考察了包括pH、温度、氧化、机械扰动、冻融循环和紫外照射在内的多种应力因素，以评估用于治疗多发性骨髓瘤的治疗性mAb——达雷木尤单抗完整形式的降解情况。结论本研究结果表明，SDS-CGE是一种用于监测daratumumab分子大小谱在应力作用下变化的快速且易用的分析方法。该方法能够将完整抗体与在酸性、碱性、冻融和紫外应力条件下形成的若干低分子量组分分离，而在所施加的机械和热条件下未观察到可检出的片段化。在氧化应力条件下，明显观察到……资助作者衷心感谢University of Debrecen（德布勒森大学）科学出版物项目、匈牙利国家研究开发与创新办公室ATBG Korea V4联合项目（#2023-1.2.1-ERA_NET-2023-00015）以及ADVANCED_150780资助项目的支持。项目编号2026-2.1.1-EK?P-2026-00020/7在匈牙利科学与技术部通过国家研究、开发与创新基金资助下实施，由……作者贡献声明（CRediT）Andras Guttman：写作——审阅与编辑、监督指导。Felicia Auer：写作——初稿撰写、方法学、调查研究。利益冲突声明作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。致谢本文是Horváth Csaba生物分离科学纪念实验室的第226篇贡献成果。利益冲突作者声明不存在利益冲突。竞争性利益作者声明不存在任何竞争性利益。Felicia Auer｜Andras Guttman