一种新型的非特异性结合方法可实现超越五规则化合物游离分数的测量

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：A novel non-specific binding method enables measurement of the fraction unbound of beyond rule-of-five compounds

　　摘要• 一种用于测定难以检测化合物的新方法，其利用了一种在体外测定中通常被认为是不利因素的特性。• 该方法可在宽广的动态浓度范围内测定游离分数（fraction unbound），相比单点浓度测定更具可靠性。• 该方法简便易行，无需专用设备，可在96孔微孔板中完成。• 相同的测定原理可应用于其他基质中游离分数的测定，用于体外孵育中的药物测定。• 该测定方法缓解了超五法则（beyond rule-of-five, bRo5）化合物中常见的难溶性和不稳定性问题。引言游离分数（F_u）是决定药物分布的关键参数，它描述了血浆中未与血浆蛋白结合的化合物所占的比例。游离药物假说指出，只有游离药物才能发挥药理学作用、穿越细胞膜，或易被代谢或清除。准确测定化合物的F_u对于理解药物的代谢与药代动力学（DMPK）特征至关重要，例如预测治疗指数或药物-药物相互作用（DDI）潜力，这会影响药物进入临床试验的进程。在追求将此前难以成药的靶点转化为药物靶点的过程中，药物化学工作日益复杂。这一趋势使新型化合物进一步进入超五法则（bRo5）空间，意味着这些新型化合物通常具有更高的脂溶性，从而导致更低的F_u。其中一类新型药物即为蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs），它们包含一个E3连接酶结合部分和一个靶蛋白配体，通过连接链相连，以促进靶蛋白的泛素化及随后的蛋白降解。这种双功能特性意味着PROTACs本身就是长链分子，导致其分子量和脂溶性较高。这些PROTACs具有挑战性较强的理化性质，阻碍了通过常规测定方法可靠地测量F_u。目前行业标准F_u测定方法是平衡透析（ED），这是一种性价比高且通量大的方法，将加入化合物的血浆与磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行透析，使未与蛋白结合的化合物被动扩散通过透析膜到达PBS腔室。通过比较血浆腔室与PBS腔室中的化合物浓度，可计算出F_u。然而，当测试高脂溶性新型化合物时，可能会出现一些问题，导致测得的F_u值准确度和可信度较低。由于此类化合物的F_u极低，这会导致PBS腔室中的化合物浓度比血浆腔室低多个数量级。这可能导致结果存在较大的误差和变异性，尤其是考虑到质谱（MS）有限的线性检测范围后更加明显。此外，随着化合物脂溶性增加，化合物对容器壁和透析膜的非特异性结合（NSB）也会增加。这会降低从ED测定中取样的化合物浓度，进一步加剧PBS腔室的质谱灵敏度问题。最重要的是，对透析膜可能存在的NSB也会形成屏障，导致几乎没有或没有化合物穿越膜，这意味着生理血浆蛋白结合（PPB）平衡在体外已无法得到体现。在本文献领域中已发表了若干种ED测定的变体，旨在提高所测F_u的准确度和重现性。稀释法将稀释后的血浆与PBS进行透析，以增加血浆腔室中的化合物浓度，使其落在线性动态质谱范围内。预饱和法涉及预先包被ED腔室表面，并向两个腔室加载接近预期平衡的化合物浓度，从而最大限度地减少腔室表面和透析膜的NSB。为实现类似效果，Solutol法向两个腔室中均添加一种表面活性剂，以减少NSB。另一种方法是通量透析法，试图通过计算化合物从加标血浆到空白血浆中透析膜初始通量速率来预测F_u。该方法可实现更高的起始化合物浓度和更少的NSB。然而，这些测定方法仍依赖透析膜，导致某些新型化合物（包括某些PROTACs）无法获得准确的F_u值，因为它们无法穿越透析膜。此外，这些方法增加的复杂性也可能干扰它们试图模拟的生理PPB平衡。很少有临床PROTAC化合物报告了F_u值，表明准确确定F_u存在困难。这些F_u测定的问题导致监管机构缺乏信心，并强制规定了F_u在监管申报中的最低限度为0.01。这导致了过度保守的DDI潜力预测、额外的临床DDI研究以及限制性药物标签。然而，欧洲药品管理局（EMA）关于临床前DDI潜力调查的新ICH M12指南显示了监管机构态度的转变，指出在申报中可使用低于最低F_u限度的值，前提是"已证明蛋白结合测定的准确性和精密度"。这表明EMA对在能够提供验证数据的情况下使用先进的血浆蛋白结合方法持新的开放态度。在此，我们提出一种新型测定方法，能够准确并重现性地测量bRo5化合物的F_u，特别是那些由于生物分析灵敏度、NSB或受限于透析膜扩散而在常规ED测定中难以测量的化合物。该方法旨在利用脂溶性化合物的NSB特性，且不需要膜。相反，关键的测定装置是标准的96孔板，简化了测定条件。该方法基于一个关键假设，即血浆中的化合物无法从PPB状态直接转变为NSB状态，而不经过在血浆中游离的中间状态。简言之，只有游离在血浆中的化合物才会非特异性地结合到容器上，从而在溶液和孔壁表面之间产生游离化合物的可逆分配。因此，表面仅与游离池通信，所以在平衡状态下，与表面相关的信号仅是游离浓度的函数；由于该信号在两个基质中以相同方式取样，其回收因子在比较时会相互抵消，从而使其可以作为基质无关的游离浓度替代指标，前提是表面结合与游离化合物之间的关系在基质之间是等同的。在理论情况下，如果在PBS和血浆中孵育的化合物在容器壁上有相同数量的NSB化合物，那么两次孵育的游离化合物浓度将相同。然而，由于血浆中存在与血浆蛋白结合的化合物，血浆孵育中的化合物浓度将高于PBS孵育。因此，PBS孵育与血浆孵育中化合物浓度的比值将等同于计算F_u，即游离化合物浓度与总化合物浓度之比（图1）。本文介绍了如何将这一概念转化为一种新型F_u测定方法，并将其应用于PPB文献中6种常见的bRo5化合物，以及3种Arvinas的临床PROTAC和2种AstraZeneca的临床前PROTAC（表1，图2）。我们的结果使得能够评估该测定方法用于测量无法通过常规方法评估的化合物的F_u的适用性。分节摘要材料从BioIVT（英国西萨塞克斯郡）获取了两批来自两个不同批次的冷冻人血浆（性别混合，K2EDTA）。PBS购自Thermo-Fisher（英国赫姆尔亨普斯德）。聚苯乙烯96孔板购自Corning（美国科宁）。液相色谱溶剂由AstraZeneca的介质制备团队（英国剑桥）生产。其他实验室耗材和材料购自VWR（美国雷德诺）。大多数测试化合物（格列本脲、拉帕替尼、胺碘酮、维奈克拉）结果该新型方法被应用于十一种化合物，其中六种是常被引用的、高度血浆蛋白结合的化合物。其余五种化合物来自AstraZeneca和Arvinas的临床前或临床PROTAC。使用人血浆作为结合基质。一个批次用于第1和第2次重复，另一个独立批次用于第3次重复。对于所有化合物，血浆和PBS孵育中[NSB]对[Solution]的幂回归均为讨论现代药物化学的进步使新设计的化合物进一步进入bRo5空间。使用现有方法准确测定具有挑战性理化性质化合物的F_u一直存在困难。这主要归因于生物分析灵敏度、NSB以及大多数测定系统中使用透析膜的问题。在bRo5空间中确定F_u的方法有限，这加剧了对候选化合物DMPK特征的理解难度，结论本研究呈现的数据表明，这种新方法能够为具有最高血浆蛋白结合程度的bRo5化合物提供准确且可重现的F_u值。随着EMA关于处理临床前DDI的新指南，本方法在测量bRo5化合物（如PROTACs）F_u值方面的验证，可能为在监管申报中使用低于0.01任意限度的F_u值提供未来先例。这可以减少DDI和剂量的保守性，利益冲突声明作者声明他们没有已知的与本文报告工作相冲突的财务利益或个人关系。作者为本期刊的编辑委员会委员/主编/副主编/客座编辑，并未参与本文的编辑审稿或发表决定。作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在利益冲突：所有致谢作者感谢Jennie Roberts在开发本测定所用生物分析方法时给予的宝贵建议，感谢Claire Donohoe和Daniel Baker对实验方法提出的深刻反馈意见。所有工作由AstraZeneca支持并在其剑桥总部完成。作者：Zichen He | James Tucker | Aaron Smith