免疫检查点抑制剂相关心肌炎实验性小鼠模型的建立

《The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics》：Development of an experimental mouse model of immune checkpoint inhibitor-related myocarditis

　　

摘要

免疫检查点抑制剂（ICI）相关性心肌炎具有较高的致死率（约42%），凸显了对有效预防和干预措施的迫切需求。尽管动物模型在临床前药物评估中不可或缺，但现有的ICI相关性心肌炎小鼠模型存在寿命短和发生率不稳定的问题。为克服这些局限性，我们利用心肌炎诱导剂处理PD-1基因敲除（KO）小鼠，建立了一种实验性心肌炎模型，并评估了其在重现人类ICI相关性心肌炎发病机制方面的能力。对BALB/c野生型和PD-1敲除（PD-1-KO；雄性，8周龄）小鼠进行心肌肌球蛋白肽免疫接种（50 ng，第0天和第7天皮下注射），与等体积的完全弗氏佐剂混合，同时腹腔注射百日咳毒素（500 ng，第0天）。21天后处死小鼠，评估心肌炎的发生情况。通过HE染色评估心肌免疫细胞浸润，并通过Masson三色染色评估纤维化情况。采用荧光免疫染色检测心肌组织中CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞的浸润情况，这两种细胞同样参与人类心肌炎的发病。利用实时PCR定量分析炎症、纤维化和心肌炎相关基因的mRNA表达水平。肌球蛋白处理的PD-1 KO小鼠表现出免疫细胞浸润增加和心肌纤维化。荧光免疫染色证实心肌组织中存在CD4⁺和CD8⁺淋巴细胞。此外，肌球蛋白处理上调了心脏中炎症细胞因子和纤维化相关基因的mRNA表达。我们成功建立了通过肌球蛋白处理PD-1 KO小鼠获得的ICI相关性心肌炎的简单且可重复的模型。该模型可能有助于新型预防和治疗策略的开发。

章节摘要

1. 引言

尽管免疫检查点抑制剂（ICI）是有效的抗肿瘤药物，可对抗多种类型的癌症，但它们会打破免疫系统的平衡，导致免疫相关不良事件（irAEs），即在多种器官中出现的类似自身免疫疾病的状况 1, 2。其中，心肌炎的发病率<1%，是最致命的不良事件，致死率为42% 3, 4。ICI相关性心肌炎、病毒性心肌炎和其他疾病均以

实验动物

使用八周龄雄性BALB/c野生型和PD-1基因敲除（PD-1 KO）小鼠作为实验动物。PD-1 KO小鼠PD-1-KO-N12（BALB/c背景） ¹³购自理研生物资源研究中心（日本茨城县）。

饲养室的相对湿度维持在50±10%，室温为26±1 °C，明暗周期为12小时（8:00开灯，20:00关灯）。七周龄雄性BALB/c野生型小鼠购自日本Crea公司，用于

免疫检查点抑制剂相关性心肌炎小鼠模型中心脏重量的变化

接受肌球蛋白肽处理的野生型小鼠（野生型+肌球蛋白组）的心脏重量与野生型组相当。同样，未接受肌球蛋白肽处理的PD-1 KO小鼠（PD-1KO组）的心脏重量与野生型组相当。随后检测了肌球蛋白给药与PD-1 KO联合对心脏重量的影响（图2）。PD-1KO+肌球蛋白组的心脏重量显著高于野生型组和野生型+肌球蛋白组，

4. 讨论

我们通过向PD-1 KO小鼠施用肌球蛋白，旨在建立ICI相关性心肌炎的实验病理模型。在第21天，PD-1KO+肌球蛋白组小鼠的心脏中观察到明显的炎症细胞浸润，表明心肌炎已发生。此外，荧光免疫染色证实PD-1KO+肌球蛋白组心肌组织中存在CD8⁺细胞。虽然未达统计学显著性，但CD8⁺细胞的数量呈现出

5. 结论

在本研究中，我们通过向PD-1基因敲除小鼠施用肌球蛋白肽，建立了一种简单且可重复的ICI相关性心肌炎实验小鼠模型。该模型很好地重现了人类ICI相关性心肌炎中观察到的病理特征，包括明显的炎症细胞浸润，特别是CD8⁺细胞，以及心肌纤维化的进展。我们的研究结果表明，该小鼠模型是阐明

利益冲突

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

CRediT作者贡献声明

Hiroto Unten：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，形式化分析，概念构思。Takahiro Niimura：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，形式化分析。Hirofumi Hamano：撰写——审阅与编辑，方法学，形式化分析。Mitsuhiro Goda：撰写——审阅与编辑。Mizuki Kanamori：撰写——审阅与编辑，形式化分析。Emika Kawata：撰写——审阅与编辑，形式化分析。Io Horikawa：撰写——审阅与编辑。Fuka Aizawa：撰写——

致谢

感谢Editage（www.editage.com）提供的写作支持。

资金支持

本工作得到了日本临床药理学研究基金会 [资助编号：2018A10] 和日本学术振兴会（JSPS）科研经费 [资助编号：18K06785、20H05798、24H02635 和 25K18654] 的资助。

Hiroto Unten|Takahiro Niimura|Hirofumi Hamano|Mitsuhiro Goda|Mizuki Kanamori|Emika Kawata|Io Horikawa|Fuka Aizawa|Kenta Yagi|Kei Kawada|Yuki Izawa-Ishizawa|Yoshito Zamami|Keisuke Ishizawa