《The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics》：Design and Functional Characterization of ERK1/2 Signaling Modulators in Lung Fibroblasts.
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哮喘发病机制涉及肺成纤维细胞（LF）和气道平滑肌（ASM）细胞过度增殖及细胞外基质产生，导致气道重塑（AR），而现有疗法对此管理不佳。细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）是炎症细胞因子和生长因子下游促有丝分裂信号的关键介质，因此是有吸引力的治疗靶点。然而，
哮喘发病机制涉及肺成纤维细胞（LF）和气道平滑肌（ASM）细胞过度增殖及细胞外基质产生，导致气道重塑（AR），而现有疗法对此管理不佳。细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）是炎症细胞因子和生长因子下游促有丝分裂信号的关键介质，因此是有吸引力的治疗靶点。然而，全局性ERK1/2抑制临床疗效有限且存在不良毒性。研究人员此前鉴定出SF-3-030，一种ERK1/2调节剂，其与底物对接位点附近的独特半胱氨酸形成共价加合物，并选择性调节激活蛋白-1（AP-1）转录因子的组分。SF-3-030在哮喘小鼠模型中减少ASM细胞增殖并减轻AR。在本研究中，研究人员报告了利用配体竞争饱和位点识别（SILCS）对SF-3-030类似物进行计算设计，并在人LF中进行功能表征。17种化合物中有8种抑制血小板衍生生长因子（PDGF）介导的LF增殖和细胞周期蛋白D1表达。活性化合物差异调节PDGF诱导的AP-1组分：两种化合物抑制c-FOS、FRA1和FOSB，而其他化合物选择性抑制FRA1。活性化合物未破坏ATP竞争性抑制剂所观察到的ERK依赖性负反馈。转录组分析显示，与成纤维细胞增殖、结缔组织产生、炎症细胞因子及调控通路相关的基因下调。与BVD-523下调基因的重叠支持ERK1/2调节在不完全抑制激酶的情况下的功能有效性。这些发现鉴定了一类具有治疗潜力的新型化合物，可减轻哮喘气道重塑的病理特征。
研究背景：气道重塑（AR，airway remodeling）是阻塞性肺疾病发病和死亡的重要因素，表现为气道平滑肌（ASM，airway smooth muscle）和肺成纤维细胞（LF，lung fibroblasts）过度增殖、细胞外基质（ECM，extracellular matrix）沉积增加及气流和肺功能受损。现有疗法尚不能有效逆转或减轻AR。炎症介质如血小板衍生生长因子（PDGF，platelet-derived growth factor）驱动AR，但靶向PDGF信号的酪氨酸激酶抑制剂在哮喘临床试验中未达主要终点或获FDA批准。细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）是炎症细胞因子和生长因子信号的核心介质，但ATP竞争性ERK1/2抑制剂存在脱靶效应、毒性、获得性耐药及抑制负反馈导致的代偿信号等问题。研究人员据此提出选择性干扰疾病相关ERK1/2底物相互作用而非完全抑制激酶，并基于此前鉴定的靶向F-recruitment site的SF-3-030开展类似物设计与功能评价。重要意义在于为减轻哮喘AR提供不依赖全局ERK抑制的候选策略。
研究人员开展了基于配体竞争饱和位点识别（SILCS）和SILCS-Covalent的计算设计，合成17个SF-3-030类似物，并在非转化人LF中与母体化合物SF-3-030及ATP竞争性抑制剂BVD-523比较，评价其对PDGF驱动增殖、ERK1/2信号、AP-1组分、细胞周期蛋白D1及转录组的影响。结论为8个化合物具有低微摩尔级抑制活性，且活性化合物部分抑制ERK1/2调节的转录程序并保留负反馈，支持选择性调节ERK1/2信号的治疗潜力。
关键技术方法（≤250字）：采用SILCS及SILCS-Covalent在ERK2晶体结构上生成FragMaps并进行共价对接和LGFE
Eq+LGFE
Rx-best评分，指导类似物设计；经标准化学合成和NMR评估纯度；在人端粒酶逆转录酶永生化原代人LF（hTERT-LF，CRL-4058）及非永生化IMR-90 LF（CCL-186）（均购自ATCC）中开展细胞增殖、LDH释放、ELISA、免疫印迹；以RNA测序和IPA分析差异基因与通路；用质谱评估大鼠ERK2半胱氨酸修饰；统计采用单因素方差分析及Dunnett校正。
研究结果：
CADD identification of SF-3-030 analogs：通过SILCS FragMaps和SILCS-Covalent结合药物化学设计，研究人员获得17个类似物；预测结合指标LGFE
Eq+LGFE
Rx-best范围为-9.8至-14.6 kcal/mol，母体SF-3-030为-10.9 kcal/mol，提示设计化合物具有有利预测结合能。
Functional characterization of test compounds established a structure-activity relationship：通过resazurin代谢检测和LDH释放实验，17个化合物中8个以低微摩尔IC
50抑制PDGF诱导的LF增殖，且在对应浓度下未见明显非特异毒性；LGFE指标较母体更有利的10个化合物中7个有活性，真阳性率70%，较母体不利的7个中仅1个有活性。
Compounds modify ERK2 cysteine residues：通过质谱检测大鼠ERK2（与人ERK2 98%一致），所有活性化合物均诱导C252的SN2取代修饰，并观察到C159和C164的SN2反应及C159的Michael加成。
Effects of active compounds on ERK1/2 signaling：通过免疫印迹，BVD-523增加ERK1/2磷酸化并抑制RSK1磷酸化；除SP-2-151和SP-2-153外，试验化合物未明显改变PDGF诱导的ERK1/2磷酸化，且对RSK1和ELK-1磷酸化影响很小或没有影响；试验化合物未显著降低CRAF负反馈位点磷酸化。
SF-3-030 analogs differentially regulate AP-1 proteins：通过PDGF时间进程和化合物处理后的免疫印迹，PDGF诱导c-FOS约1 h达峰、FRA1和FOSB约2 h达峰；多数活性化合物在IMR90中增加c-FOS，SP-2-090、SP-2-096、SP-2-151和SP-2-153在hTERT-LF中抑制FRA1，所有化合物在IMR90中抑制FRA1，BVD-523及SP-2-151、SP-2-153抑制FOSB。
Compounds inhibit PDGF-induced cyclin D1 expression：通过免疫印迹，SF-3-030类似物抑制PDGF诱导的细胞周期蛋白D1表达，SP-2-151在IMR90中未抑制，BVD-523在两种细胞中均抑制。
Transcriptome analysis revealed differential gene expression in response to treatment with SF-3-030 analogs：通过RNA测序和IPA，BVD-523抑制约70%的PDGF上调基因，SF-3-030及SP-2-151、SP-2-153、SP-2-156抑制较少基因，支持部分而非完全抑制ERK1/2信号；化合物下调差异基因与BVD-523下调基因约50%重叠。SP-2-156下调成纤维细胞增殖、结缔组织产生、炎症细胞因子及FOXM1相关基因；SP-2-153下调CCND1、EGF、ERBB2及TNF、IL4、IL1B等；SP-2-151、SP-2-153、SP-2-156上调CCNG2和FOSB。共同下调的AP-1相关基因包括PDGFB、TRAF1、MYB、GPR68，c-MYB和胶原A1蛋白及IL-6分泌相应降低。HMOX1被所有测序化合物上调，但SP-2-151和SP-2-153未相应增加HO-1蛋白。通路和上游调控分析显示化合物与BVD-523 qualitatively相似但Z分数较低；负反馈相关DUSP和SPRY基因总体保持或上调，支持维持ERK1/2负反馈调节。
讨论部分总结：研究人员认为靶向ERK1/2底物对接位点可在保留负反馈的同时干扰疾病相关底物。SILCS FragMaps界定了C254附近功能团亲和需求，LGFE排序与细胞活性相关；活性差异与结合模式、弹头反应性、离去基团稳定性及细胞通透性和稳定性等因素有关。多数化合物不影响PDGF诱导的ERK1/2磷酸化，保留D-domain底物RSK1和ELK-1磷酸化及CRAF负反馈磷酸化，SP-2-151和SP-2-153例外地降低ERK1/2磷酸化。化合物总体增加c-FOS、降低FRA1，并抑制细胞周期蛋白D1及AP-1调控基因。SP-2-151和SP-2-153结构相似，SP-2-151含叔丁氧羰基（Boc）基团，二者转录组效应相似并诱导HSP70基因；与BVD-523共享约50%下调基因支持在靶效应。HMOX1上调而SP-2-151、SP-2-153未增加HO-1蛋白，提示转录后调控；NR4A1、ATF3、ID2/3、IRS2等上调可能有利于减轻炎症。研究支持选择性调节而非完全抑制ERK1/2，但当前仅考察一种肺细胞类型，不能反映AR和哮喘中多细胞相互作用，未来需动物模型验证体内有效性。
研究结论翻译：本研究利用先进的计算和药物化学工具鉴定了一类新型ERK1/2信号调节剂。这些化合物可有效抑制与肺成纤维细胞中哮喘病理特征相关的多种信号和功能结局。最重要的是，这些化合物与ATP竞争性ERK抑制剂共享基因/通路，但具有独特差异。值得注意的是，本研究支持对ERK1/2信号进行选择性调节而非完全抑制，以实现理想生物学结局，并有可能减少抑制全部ERK1/2活性药物所观察到的不良毒性。此外，当前研究仅考察化合物在一种肺细胞类型中的作用，不能反映气道重塑和哮喘发病机制中多种细胞类型之间的复杂相互作用。未来研究将利用动物模型阐明这些化合物在减轻哮喘病理特征方面的体内有效性。
