利鲁唑衍生的苯并[d]噻唑类化合物作为肌萎缩侧索硬化相关神经退行性疾病中的CK1δ抑制剂

《ChemMedChem》：Riluzole-Derived Benzo[d]thiazoles as CK1δ Inhibitors for Amyotrophic Lateral Sclerosis-Related Neurodegeneration

　　

专业术语翻译的论文摘要 基于利鲁唑（Riluzole）代谢产物设计的一系列苯并[d]噻唑（benzo[d]thiazoles）被研究作为代谢物启发的CK1δ（酪蛋白激酶1δ亚型）抑制剂，该激酶参与TDP-43（反式激活应答DNA结合蛋白43 kDa）磷酸化，因此与肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）密切相关。从已知的利鲁唑对CK1δ的活性出发，研究人员考察了其主要羟胺代谢物是否能保留靶点识别能力，并为骨架优化提供合理切入点。该代谢物保留了CK1δ抑制活性，但其有限的化学稳定性和在神经元细胞中的毒性将羟胺基团确定为关键缺陷。将此官能团替换为肼基（hydrazine）后，将脆弱的代谢物衍生结构转化为更有效且易处理的CK1δ抑制剂系列。构效关系（Structure–activity relationship, SAR）研究表明，肼基部分比相应的羟胺类似物能够容纳更广泛的取代基，其中支链烷基和苄基表现出最均衡的活性特征。分子对接和分子动力学模拟表明，这种改善可归因于与铰链区Gly86形成的额外氢键。最佳衍生物兼具亚微摩尔级别的CK1δ抑制活性、被动血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）通透性、短期细胞耐受性、ATP竞争性抑制、直接的靶点结合能力以及对GSK3β（糖原合酶激酶3β）的初步选择性。尽管该化合物在氧化应激模型中未显示出神经保护作用，但它为探索CK1δ在ALS中的生物学功能奠定了一个聚焦的苯并[d]噻唑平台。

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研究背景与目的

肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其特征为大脑和脊髓中运动神经元的进行性丧失，患者通常在症状出现后3-5年内死亡。尽管已有利鲁唑（Riluzole）、依达拉奉（Edaravone）等少数药物获批，但现有疗法效果有限，无法治愈疾病。在此背景下，酪蛋白激酶1δ（CK1δ）作为一个新兴药理学靶点引起了广泛关注。CK1δ是一种组成型活性的丝氨酸/苏氨酸激酶，其与ALS的联系主要通过TDP-43蛋白展开。TDP-43是绝大多数ALS病例中泛素化胞质包涵体的主要成分，而CK1δ可磷酸化TDP-43的C端多个残基，促进其在细胞质中的错误定位和聚集。已有研究表明，在散发性ALS患者的脊髓和前额叶皮层组织中CK1δ表达增加，遗传敲低或药理学抑制CK1δ可降低TDP-43磷酸化水平。

值得注意的是，利鲁唑作为一种2-氨基苯并[d]噻唑衍生物，既是FDA批准的ALS治疗药物，又已被研究人员发现能以微摩尔级效力抑制CK1δ。然而，利鲁唑的临床获益有限，且其药理机制复杂。本研究旨在利用利鲁唑的代谢途径作为药物化学切入点，探索其代谢产物是否保留CK1δ识别能力，并通过结构优化开发更具潜力的CK1δ抑制剂，以期获得用于研究CK1δ在ALS中作用的化学工具。

研究方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：

1. 1.
   分子对接与分子动力学模拟：使用CK1δ晶体结构（PDB ID 5OKT）进行分子对接，预测化合物与ATP结合位点的相互作用模式；并采用监督分子动力学（SuMD）和经典分子动力学模拟评估配体-靶标结合过程的动态特征。
2. 2.
   有机合成与构效关系（SAR）研究：通过亲核取代反应和钯催化的Buchwald-Hartwig胺化反应，合成了一系列2-位取代的6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑衍生物，包括羟胺类和肼类两个子系列。
3. 3.
   体外生化与生物物理评价：采用荧光素酶法检测化合物对重组CK1δ的抑制活性并测定半数抑制浓度（IC₅₀）；通过热迁移实验（Thermal Shift Assay）验证化合物与CK1δ的直接结合；利用Lineweaver-Burk作图法分析化合物20对ATP的竞争性抑制模式。
4. 4.
   细胞学评价：在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系中进行MTT细胞活力测定评估化合物毒性，并在乙炔酸（ethacrynic acid）诱导的氧化应激模型中测试化合物的神经保护活性。
5. 5.
   理化性质评估：使用平行人工膜渗透性测定法（BBB-PAMPA）评估化合物的被动血脑屏障通透性，并计算脂溶性效率（LipE）分析效价与亲脂性的平衡。

研究结果

2.1 设计原理：从利鲁唑代谢到靶向CK1δ的苯并[d]噻唑

分子对接研究表明，利鲁唑的主要N-羟胺代谢物（RPR 112512，化合物2）可被容纳于CK1δ的ATP结合位点，其苯并[d]噻唑核心位于腺嘌呤结合区域，并与Leu85形成氢键相互作用。这为该代谢物作为相关CK1δ导向化学型的合理性提供了结构依据。同时，由于该羟胺基团的O-葡萄糖醛酸化是其主要代谢消除途径，研究人员探索了两种互补策略：O-烷基化封闭结合位点，以及用肼基作为生物电子等排体替换羟胺。对接显示，2-肼基衍生物（化合物8）的结合姿态与化合物2几乎完全重叠，且与Gly86存在额外相互作用。

2.2 化学合成

研究人员制备了包含19个2-氨基-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑衍生物的聚焦库，分为三个子系列：N-甲基化衍生物（9-10）、羟胺衍生物（2，11-16）和肼基衍生物（8，17-25）。所有合成均以商品化的2-氯-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑（26）为共同起始原料。对于羟胺和肼基子系列，研究人员采用了Boc保护/Pd催化的Buchwald-Hartwig胺化/脱保护的合成策略，以控制化学选择性和避免过度芳基化。

2.3 构效关系研究

通过对合成化合物进行CK1δ抑制活性筛选，研究人员揭示了清晰的构效关系。N-羟胺代谢物2的IC₅₀为35.1 μM，证实其保留了CK1δ识别能力。将羟胺替换为肼基后，化合物8的IC₅₀降至3.64 μM，实现了约十倍的效力提升。N-甲基化衍生物（9和10）活性丧失，表明2-位的氢键供体对活性至关重要。

在羟胺子系列中，只有线性戊基取代的化合物13表现出低微摩尔级活性（IC₅₀=4.40 μM），而支链或更大体积的取代基均无效。相比之下，肼基子系列展现出更宽的取代耐受性：甲基（17）、丙基（18）和戊基（19）衍生物均保持低微摩尔级活性。尤为重要的是，异戊基衍生物20达到亚微摩尔级活性（IC₅₀=0.917 μM），成为全系列中最有效的化合物。苄基衍生物23也表现优异（IC₅₀=1.62 μM）。芳香族取代基（22-25）普遍被耐受，其中苄基衍生物活性最高。唯一失败的肼基类似物是大体积的2-乙基己基衍生物21，表明远端取代基存在空间限制。

2.4 计算研究

分子对接结果确认了苯并[d]噻唑核心与铰链区Leu85的双齿氢键作用。监督分子动力学模拟比较了化合物20（高效肼基衍生物）和14（无效羟胺衍生物），揭示了两者在结合过程中的显著差异：化合物20具有更短的结合轨迹和更明确的适应阶段，而化合物14则需要更长的模拟时间并表现出多个中间状态。每原子静电相互作用能分析表明，化合物20中2-位氮原子（N3）及其连接的氢原子（H16）贡献了强烈的有利静电能量，而化合物14中等效位置的氧原子则呈现不利的能量贡献。进一步100 ns经典分子动力学模拟证实，化合物20能与Leu85和Gly86维持高频率的氢键相互作用，而化合物14仅保留与Leu85的相互作用，无法与Gly86形成氢键。这解释了肼基取代带来的效力提升。

2.5 苯并[d]噻唑系列的理化和成药性分析

稳定性实验表明，化合物2在DMSO中储存28天后纯度从95.7%降至81.7%，而化合物20在同一条件下仅从100.0%降至93.8%，显示出显著改善的化学稳定性。脂溶性效率分析表明，化合物20和23在CK1δ效价与亲脂性之间取得了最佳平衡。所有测试的化合物均被归类为CNS+（中枢神经系统阳性），表明优化后的肼基衍生物保持了良好的被动血脑屏障通透性。

2.6 苯并[d]噻唑系列的生化与细胞评价

Lineweaver-Burk分析表明，化合物20在不同ATP浓度下呈典型的ATP竞争性抑制模式。热迁移实验显示，化合物20以剂量依赖方式使CK1δ的熔解温度升高，最大ΔTm达+2.0 °C，提供了直接的靶点结合证据。初步选择性评价显示，化合物20在10 μM浓度下对GSK3β无抑制活性，对CK1ε的IC₅₀为6.20 μM（约为CK1δ的6.8倍），且在50 μM浓度下对p38α的抑制率低于50%。细胞活力实验显示，化合物20和23在5 μM浓度下耐受良好，而代谢物2在该浓度下即表现出明显的细胞毒性。然而，在乙炔酸诱导的氧化应激模型中，利鲁唑、化合物20和23均未显示出显著的神经保护作用。

总结与结论

本研究建立了利鲁唑代谢、CK1δ抑制和苯并[d]噻唑药物化学之间的关联框架。主要发现如下：利鲁唑的N-羟胺代谢物保留了CK1δ抑制活性，但其化学不稳定性和细胞毒性限制了其应用价值。将羟胺替换为肼基后，成功将这一代谢物启发的起点转化为更有效且化学稳定的CK1δ导向化学型。构效关系研究表明，中等大小的支链烷基和苄基是最优取代基，其中异戊基衍生物20脱颖而出，兼具亚微摩尔级CK1δ抑制活性、改善的稳定性、维持的被动血脑屏障通透性、ATP竞争性抑制行为、直接的靶点结合能力、约七倍于CK1ε的选择性偏好，以及在筛选浓度下对GSK3β和p38α无抑制活性。分子动力学模拟揭示了2-位氢键供体（如肼基中的NH）通过与Gly86形成额外氢键来稳定结合的动态机制。

尽管化合物20在乙炔酸氧化应激模型中未显示出神经保护作用，但这一定位了该系列化合物的精确角色：它们并非利鲁唑的直接功能模拟物，而是源自其代谢谱的、聚焦于CK1δ的苯并[d]噻唑工具。该化合物的鉴定表明，代谢物启发的修饰可以在保持中枢神经系统相容性被动通透性的同时，递送更有效和更具选择性的CK1δ抑制剂。未来工作将集中于降低该骨架的亲脂性负担，同时保留基于肼基的识别模式，以开发用于研究CK1δ在ALS中作用的更有效和更均衡的化学工具。