IL-35通过STAT3-MAPK/ERK-eNOS信号轴改善肥胖相关内皮依赖性血管舒张功能障碍

《Immunity, Inflammation and Disease》：Interleukin-35 Ameliorates Obesity-Associated Impairment of Endothelium-Dependent Vasodilation via the STAT3-MAPK/ERK-eNOS Signaling Axis

　　

背景：肥胖损害内皮型一氧化氮合酶（eNOS）-一氧化氮（NO）信号，触发慢性炎症、内皮功能障碍和血管舒张缺陷，进而驱动心血管代谢疾病。现有代谢治疗仅提供间接血管保护，且不能解决残余的炎症介导心血管风险。作为抗炎性白细胞介素12（IL-12）家族细胞因子，白细胞介素35（IL-35）在肥胖中被抑制，并在炎症条件下发挥血管保护作用，但其在肥胖相关内皮血管舒张功能障碍中的功能及潜在机制仍未明确。
材料与方法：通过8周高脂饮食（HFD）喂养建立肥胖小鼠模型，随后腹腔注射重组小鼠IL-35 4周。采用主动脉环实验评估血管舒张功能。以棕榈酸（PA）处理人脐静脉内皮细胞（HUVECs）复现脂毒性内皮损伤，并给予重组人IL-35处理。应用蛋白免疫印迹（Western blotting）、免疫荧光、4-氨基-5-甲氨基-2′,7′-二氟荧光素二乙酸酯（DAF-FM DA）检测和免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）检测IL-35亚基（EB病毒诱导基因3（EBI3）和白细胞介素12α亚基（IL-12A））水平、eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）信号分子（细胞快速加速纤维肉瘤（cRAF）、丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）和ERK）磷酸化及信号转导与转录激活因子3（STAT3）激活、NO生成和eNOS结合伴侣。采用Raf或ERK特异性抑制剂和STAT3小干扰RNA（siRNA）进行救援实验。
结果：HFD小鼠主动脉内皮EBI3表达降低、内皮依赖性血管舒张受损、eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化降低和NO生成减少；外源性IL-35可逆转上述表型。IP-MS和免疫印迹显示，IL-35增强eNOS-ERK1相互作用，并恢复PA抑制的cRAF、MEK、ERK和eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化，而Raf或ERK阻断可消除这些效应。此外，IL-35恢复PA抑制的STAT3磷酸化，而STAT3敲低削弱IL-35驱动的MAPK/ERK激活、eNOS磷酸化及后续NO生成。
结论：IL-35通过STAT3-MAPK/ERK-eNOS轴改善肥胖诱导的内皮依赖性血管舒张障碍，该轴提高eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化和NO合成。该研究支持IL-35作为肥胖相关血管并发症的潜在治疗候选物。

研究背景与问题：肥胖是重大全球公共卫生负担，2022年全球约5.04亿女性和3.74亿男性患肥胖，显著增加2型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝病、睡眠呼吸暂停、骨质疏松和多种癌症易感性。肥胖触发的内皮功能障碍是这些疾病的中心病理驱动因素。内皮细胞形成血管腔单层，主要通过内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS；内皮NO合成限速酶）维持血管稳态。eNOS-NO轴介导内皮依赖性血管舒张，抑制血小板聚集和黏附，抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）过度生长，并发挥抗炎、抗氧化作用。eNOS活性受翻译后修饰调控，Ser¹¹⁷⁷磷酸化是重要激活修饰，可显著提高酶活性。高脂血症、高血糖和炎症等病理应激下，eNOS活性和NO生物利用度下降，促进血管收缩、炎症、氧化应激、异常增殖、凝血失调和黏附分子上调，导致内皮功能障碍并加速心血管代谢疾病进展。肥胖相关慢性低度炎症可独立于体重和代谢指标驱动内皮损伤及心血管并发症；现有减重和降脂药物（如liraglutide、orlistat、statin）的内皮获益多为体重、血糖和血脂改善后的部分间接保护，部分患者即使代谢控制良好仍存在慢性炎症和内皮功能障碍，遗留残余心血管风险。因此，直接靶向血管炎症微环境和eNOS功能仍是未满足的临床需求。IL-35是抗炎性IL-12家族细胞因子，主要由调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）分泌；肥胖时循环IL-35降低，原文认为可能归因于Treg功能耗竭。临床前研究显示IL-35可抗动脉粥样硬化、肺动脉高压、缺血性血管损伤和自身免疫炎症，但其能否逆转肥胖诱导的内皮依赖性血管舒张障碍及介导该保护作用的胞内信号级联尚不明确。基于此，研究人员探索IL-35对肥胖相关内皮血管舒张功能障碍的保护作用，并表征介导该效应的STAT3-MAPK/ERK-eNOS信号轴，以填补IL-35作为代谢性内皮损伤候选治疗靶点的知识空白。研究显示，IL-35可改善肥胖相关内皮依赖性血管舒张功能障碍，机制为激活STAT3-MAPK/ERK-eNOS轴，提高eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化和NO产生；该发现拓展了IL-35血管生物学认识，并支持IL-35作为代谢性血管损伤的前瞻性治疗候选物。

关键技术方法：研究使用30只雄性C57BL/6 J小鼠（Vital River Laboratory Animal Technology，中国）建立8周HFD肥胖模型，并以重组小鼠IL-35腹腔注射4周；人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs；Procell Life Science & Technology，中国）经PA处理构建脂毒性模型。主要方法包括主动脉环血管张力测定、Western blotting、免疫荧光共定位、DAF-FM DA NO荧光检测、免疫沉淀-质谱联用（immunoprecipitation-mass spectrometry，IP-MS）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）、血清生化检测，以及Raf/ERK抑制剂和STAT3小干扰RNA（siRNA）救援实验；采用单因素/双因素方差分析和t检验。

研究结果：
3.1 饮食诱导肥胖模型的建立及IL-35对血清脂质谱的影响：通过每周体重监测、第8周空腹和随机血糖检测及第12周血清脂质检测，HFD组体重较对照增加超过1.2倍且血糖升高，确认饮食诱导肥胖模型建立；第12周HFD组甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）均显著升高；IL-35显著降低血清TG，但不改变TC、LDL-C和HDL-C。结论为IL-35选择性降低循环TG而不影响胆固醇代谢。
3.2 IL-35亚基EBI3在肥胖小鼠主动脉和PA处理HUVECs中下调并可被外源性IL-35恢复：通过免疫荧光共定位（CD31标记内皮）、Western blotting和ELISA，HFD小鼠主动脉内皮CD31表达下调并由IL-35恢复；主动脉内皮EBI3荧光强度和蛋白表达在HFD组降低、IL-35补充后升高；IL-12A在各组无显著差异；HFD组血清IL-35显著降低；PA处理的HUVECs中EBI3蛋白显著降低，100 ng/mL IL-35可显著上调EBI3，IL-12A不变。结论为肥胖伴系统性IL-35降低和内皮EBI3表达抑制，外源性IL-35选择性上调EBI3而不显著影响IL-12A。
3.3 IL-35恢复eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化和NO生成以增强肥胖中的内皮依赖性舒张：通过主动脉环ACh和SNP舒张实验、Western blotting及DAF-FM DA NO荧光检测，HFD小鼠ACh诱导的内皮依赖性血管舒张和最大舒张显著降低，IL-35治疗明显改善；SNP诱导的内皮非依赖性血管舒张在HFD组亦降低，但IL-35仅呈非显著改善趋势；HFD小鼠主动脉和PA处理HUVECs中eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化显著降低，总eNOS无显著差异，IL-35恢复p-eNOS（Ser¹¹⁷⁷）；PA降低的NO产生被IL-35显著逆转。结论为IL-35主要改善肥胖损害的内皮依赖性血管舒张，并恢复eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化和NO生成。
3.4 IL-35诱导MAPK/ERK信号通路，从而增强内皮细胞eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化和NO生成：通过IP-MS、STRING蛋白互作网络分析、Raf抑制剂sorafenib和ERK抑制剂救援实验、Western blotting及NO荧光检测，IP-MS显示IL-35处理组eNOS与ERK1（MAPK3）相互作用显著增加，前20位差异结合蛋白中仅ERK1与eNOS直接互作；PA降低cRAF、MEK、ERK和eNOS磷酸化，IL-35升高这些磷酸化水平，Raf抑制可逆转；ERK抑制同样逆转IL-35诱导的p-ERK、p-eNOS（Ser¹¹⁷⁷）和NO产生增加。结论为IL-35通过激活MAPK/ERK增强eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化和NO生成，Raf或ERK阻断可消除该效应。
3.5 IL-35激活STAT3-MAPK/ERK-eNOS信号轴以促进内皮细胞eNOS磷酸化和NO生成：通过STAT3 siRNA转染、Western blotting和NO荧光检测，PA降低STAT3、eNOS、cRAF、MEK和ERK磷酸化，IL-35逆转这些降低；STAT3沉默显著降低p-STAT3、总STAT3、p-eNOS（Ser¹¹⁷⁷）、总eNOS以及cRAF、MEK、ERK磷酸化，并减弱IL-35诱导的NO释放。结论为STAT3是IL-35激活MAPK/ERK-eNOS轴的上游节点，STAT3抑制削弱IL-35诱导的MAPK/ERK激活、eNOS表达/磷酸化和NO生成。

讨论部分总结：讨论指出，肥胖诱导的内皮功能障碍以eNOS-NO信号紊乱和内皮依赖性血管舒张受损为特征，是心血管代谢疾病进展的关键驱动因素；现有代谢治疗多经间接、代谢依赖机制提供血管保护，残余慢性炎症和持续内皮功能障碍仍常见，因此需要直接靶向血管炎症微环境和内皮功能的干预。研究支持HUVECs数据与小鼠主动脉发现具有转化相关性：eNOS激活、MAPK/ERK级联和STAT3信号在静脉与动脉内皮细胞及人与小鼠间高度保守；PA诱导的HUVECs脂毒性损伤可复现HFD诱导主动脉内皮功能障碍的关键特征，包括eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化降低和NO产生减少；细胞模型便于开展IP-MS互作组和siRNA介导沉默等机制分析，且体外与体内结果一致。讨论还指出，IL-35不改变胆固醇代谢但显著降低TG，可能通过下调PPARγ和C/EBPα抑制脂肪生成分化与TG蓄积；肥胖小鼠血清IL-35系统性降低，而主动脉内皮EBI3特异性下调，外源性IL-35选择性上调EBI3而不影响IL-12A；由于未进行EBI3或IL-12A基因缺失实验，不能正式确定亚基失衡如何塑造肥胖内皮损伤中的IL-35生物学。讨论认为内皮细胞可能低水平产生IL-35，但内皮来源IL-35分泌缺乏直接证据；ELISA或共免疫沉淀未检测到内皮细胞分泌IL-35或EBI3-IL-12A复合物的明显差异，可能归因于内源性IL-35产生低、细胞因子生化不稳定和降解、培养上清或血浆中残余外源重组IL-35干扰，因此内皮IL-35生物合成推断主要基于亚基免疫荧光和Western blotting检测而非直接测定组装异二聚体。讨论指出ACh诱导的内皮依赖性血管舒张在HFD组显著受损且IL-35明显改善，而SNP诱导的内皮非依赖性血管舒张仅呈非显著改善趋势，提示系统给予外源IL-35主要保护内皮层而非直接强效影响中膜VSMC；该差异主要归因于内皮单层构成血液与血管中膜间功能性弥散屏障，中膜VSMC细胞因子微环境主要由血管周围脂肪组织（perivascular adipose tissue，PVAT）和外膜旁分泌维持，腹腔注射IL-35主要提高循环IL-35浓度，优先作用于直接暴露于血液的内皮细胞，难以穿过内皮屏障到达VSMC；肥胖诱导的慢性低度炎症通过过度p38通路激活驱动脂肪组织Treg功能耗竭，是循环和PVAT微环境IL-35缺乏的关键驱动因素，内源性PVAT来源IL-35对VSMC的旁分泌作用尚需脂肪组织或Treg特异性IL-35基因消融验证。讨论还总结，IP-MS结合蛋白互作网络分析鉴定ERK1为关键差异eNOS结合伴侣，Raf和ERK抑制剂救援实验证实IL-35通过激活MAPK/ERK增强eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化和NO产生；IL-35对MAPK信号呈情境依赖调控：在LPS诱导脓毒症等炎症主导模型中抑制过度MAPK激活以抗炎保护，而在肥胖相关慢性脂毒性应激、Raf-MEK-ERK级联受抑时恢复该通路以驱动eNOS依赖NO合成。讨论提出STAT3是MAPK/ERK-eNOS轴上游激活因子，肥胖相关脂毒性应激重塑内皮受体库和STAT偶联谱，驱动优先STAT3激活，构成非经典信号方式；经典范式将MAPK置于STAT上游，但其他细胞背景证据支持反向调控关系，提示STAT3与MAPK/ERK形成相互调节反馈环而非简单单向级联。讨论还指出STAT3沉默降低总eNOS蛋白丰度，因eNOS启动子已鉴定功能性STAT3结合位点，提示STAT3可能在转录水平维持基础eNOS表达，但该直接转录控制仍需染色质免疫沉淀验证。局限性包括：多数机制实验在体外完成，体内复杂病理微环境是否完全复现尚不清楚；体内实验仅用雄性小鼠，性别差异影响肥胖相关血管损伤和内皮功能调控，需在雌性模型验证；小鼠与人血管生理和免疫调控机制存在根本差异，需在原代人动脉内皮细胞或临床样本中验证；研究仅用外源IL-35干预，缺乏基因敲除或中和抗体功能缺失验证；部分实验样本量小可能高估效应量；重组IL-35成本高且不稳定限制临床转化，未来需寻找诱导内源性IL-35表达的小分子化合物。研究结论翻译：总之，本研究表明，IL-35通过激活STAT3-MAPK/ERK-eNOS信号轴，增强eNOS Ser¹¹⁷⁷磷酸化和NO产生，从而改善肥胖相关内皮依赖性血管舒张障碍；这些发现确立IL-35作为肥胖相关心血管和代谢并发症的有前景治疗靶点。