独立队列中WID-CIN DNA甲基化检测用于宫颈上皮内瘤变3级及以上病变检出的诊断准确性验证

《International Journal of Cancer》：Validation of the WID-CIN Methylation Test for Detection of Cervical Intraepithelial Neoplasia Grade 3 or Worse in an Independent Cohort

许多宫颈筛查项目依赖细胞学对高危人乳头瘤病毒（hrHPV）阳性女性进行分流。然而，细胞学分流的敏感性不稳定且常有限，在资源匮乏环境中其可及性可能受限。WID-CIN（Women's cancer risk IDentification cervical intraepithelial neoplasia）检测是一种DNA甲基化检测，已显示作为替代分流检测具有较好的诊断准确性。在本病例对照研究中，女性从英国和希腊的阴道镜诊所招募。病例定义为组织学确诊宫颈上皮内瘤变3级或宫颈癌（CIN3⁺）的女性（n=128），对照（n=119）为组织学和/或细胞学证据显示宫颈正常者。研究评估WID-CIN指数的准确性，并使用经过验证的生物标志物工具包评价该指数的质量。WID-CIN指数在所有女性（不论hrHPV状态）中诊断CIN3⁺的曲线下面积（AUC）为0.898（95% CI：0.860–0.936）。仅在hrHPV阳性女性中（N=108），AUC为0.875（95% CI：0.793–0.956）。与既往研究相反，WID-CIN在30岁以下女性（N=57）中保持高准确性，AUC为0.857（95% CI：0.762–0.952）。因此，WID-CIN指数似乎是一种极具前景的转化生物标志物，并可能为阴道镜诊所提供有效分流。仍需在纳入筛查人群的大型前瞻性研究中进一步验证，并与包括细胞学在内的现有方法进行比较。

论文主体部分解读：

在资源丰富国家，随着国家疫苗和筛查规划的成功实施，宫颈癌发病率显著下降，并促进了宫颈上皮内瘤变（CIN）的诊断和治疗。许多筛查项目已转向以高危人乳头瘤病毒（hrHPV）初筛为主，hrHPV检测对高级别CIN具有接近90%的高敏感性；但筛查年龄女性中约13%、年轻女性中约28%为hrHPV阳性，导致特异性较差。因此，hrHPV阳性女性常接受细胞学分流，而细胞学敏感性估计在53%至75%之间波动，且近期研究显示细胞学分流对长期癌症风险并无保护作用；在疾病负担仍高且缺乏有组织筛查的资源匮乏地区，细胞学常不可用。DNA甲基化是一种化学表观遗传机制，在细胞癌变过程中异常程度增加；作为生物标志物，DNA甲基化化学性质稳定，适合高通量自动化，并且不同于细胞学，可用于自采样样本分析。然而，与大多数新兴生物标志物一样，少有检测受到质量批判并在独立队列中验证。WID-CIN检测基于5000个胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）位点的甲基化，最初通过岭回归应用于372名瑞典女性宫颈细胞样本的表观基因组关联研究（EWAS）而建立；初始研究显示该检测对CIN3⁺的AUC为0.92（95% CI：0.88–0.96），但在30岁以下女性中准确性有所降低，AUC为0.86（95% CI：0.77–0.96）。Bowden et al.近期在来自英国和希腊的女性队列宫颈样本中开展了EWAS。本研究旨在评估WID-CIN检测在这一独立开展的EWAS中的诊断准确性，并使用新开发的生物标志物工具包对该检测进行批判性评价。该研究为病例对照研究，研究对象来自英国和希腊三所大学附属教学医院的阴道镜诊所，2014年至2020年招募；病例为组织学确诊CIN3或浸润性宫颈癌（ICC）的非妊娠18岁以上女性，对照为阴道镜下细胞学和/或组织学确认宫颈正常的女性。研究共纳入247名女性，其中病例128例、对照119例。WID-CIN评分在病例中显著高于对照，中位数分别为0.982（四分位距IQR：2.255）和?0.546（IQR：0.369），p<2.2e?16；癌症病例评分高于CIN3/宫颈腺上皮内瘤变（CGIN）病例，后者又高于对照。该检测在全部女性中诊断CIN3⁺的AUC为0.898（95% CI：0.860–0.936），在hrHPV阳性女性中AUC为0.875（95% CI：0.793–0.956），在30岁以下女性中AUC为0.857（95% CI：0.762–0.952），在30岁及以上女性中AUC为0.906（95% CI：0.865–0.948）。研究结论提示，WID-CIN指数是一种极具前景的转化生物标志物，可能为阴道镜诊所提供有效分流；但仍需在大型前瞻性研究中进一步验证，并需与包括细胞学在内的现有方法比较。其意义在于为hrHPV阳性女性分流提供潜在替代策略，尤其可能适用于细胞学受限场景，并支持进一步研究DNA甲基化检测在宫颈筛查分流中的应用。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员从英国Queen Charlotte's and Chelsea Hospital、St Mary's Hospital（Imperial College Healthcare NHS Trust）和希腊Aristotle University of Thessaloniki Hospital的阴道镜诊所及妇科服务招募2014—2020年参与者，样本队列来源明确；病例与对照按组织学和/或细胞学诊断定义。宫颈样本以cytobrush采集，进行14型hrHPV检测；提取全基因组DNA，经亚硫酸氢盐转化后，用Infinium Human Methylation EPIC BeadChip（850K阵列）评估全基因组DNA甲基化。研究人员将原发表的WID-CIN指数应用于当前甲基化数据集，采用受试者工作特征曲线（ROC）及AUC评估判别性能，并用Youden指数确定最佳阈值，计算敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV），PPV/NPV按ATHENA研究中hrHPV阳性女性CIN3⁺预期患病率8.79%调整。研究人员还使用生物标志物工具包（Biomarker Toolkit）从分析有效性（AV）、临床有效性（CV）和临床效用（CU）三个域评价WID-CIN质量。

研究结果：

3.1 患者特征。通过质量控制后，247名女性的样本适合DNA甲基化分析；在328份2—4 mL样本中，239份从2 mL获得足够DNA，另8份从4 mL获得足够DNA，81份因第二次提取DNA质量不足被排除。247名可分析女性中，128例有CIN3或浸润性癌的组织学证据并归为病例，119例有正常健康宫颈的组织学和/或细胞学证据归为对照。病例包括69例CIN3、5例CGIN和54例浸润性癌；WID-CIN阳性者在病例中为93/128（72.7%），在对照中为6/119（5.0%），p<2.2e?16。年龄、吸烟状态、产次和族裔在病例与对照间总体差异无统计学意义。

3.2 WID-CIN准确性。通过比较病例与对照的WID-CIN评分并进行ROC分析，研究人员发现病例评分显著高于对照，癌症评分高于CIN3/CGIN，CIN3/CGIN又高于对照。全部女性中，WID-CIN指数诊断CIN3⁺的AUC为0.898，敏感性0.727（95% CI：0.641–0.802），特异性0.950（95% CI：0.893–0.981）；hrHPV阳性女性中AUC为0.875，敏感性0.814（95% CI：0.716–0.89），特异性0.864（95% CI：0.651–0.971）。癌症对对照的AUC为0.927（95% CI：0.881–0.974），特异性0.958（95% CI：0.905–0.986）；癌症对≤CIN3的AUC为0.855（95% CI：0.793–0.918）；仅组织学确诊样本中CIN3⁺对对照的AUC为0.925（95% CI：0.889–0.962）；CIN3/CGIN对对照的AUC为0.877（95% CI：0.826–0.928）；ICC对对照的AUC为0.927（95% CI：0.881–0.974）。在病例中，WID-CIN评分与年龄相关（Spearman's ρ=0.42，p<0.001），对照中无此相关（ρ=?0.15，p=0.099）；按疾病严重程度分层后，CIN3/CGIN病例（ρ=0.20，p=0.086）和ICC病例（ρ=0.18，p=0.189）中相关性均未达统计学显著。30岁以下女性AUC为0.857，敏感性0.765（95% CI：0.588–0.893），特异性0.870（95% CI：0.664–0.972）；30岁及以上女性AUC为0.906，敏感性0.745（95% CI：0.644–0.829），特异性0.958（95% CI：0.897–0.989）。WID-CIN阈值为?0.0801719。

3.3 WID-CIN与混杂因素。通过完整病例分析和多重插补（MI）的多变量线性回归，研究人员未发现WID-CIN与吸烟（是 vs. 否：β=?0.01；95% CI ?0.70至0.68；p=0.98，MI）或产次≥1 vs. 0（β=0.35；95% CI ?0.17至0.87；p=0.178，MI）存在关联证据；与年龄存在非常小且非显著的关联（β=0.01/年；95% CI ?0.00至0.03；p=0.061，MI）。

3.4 WID-CIN质量评估。通过生物标志物工具包评估，WID-CIN如Barrett et al.发表时所示具有高分析有效性（81.11%），反映较强的技术稳健性和可重复的检测性能；临床有效性为中等（47.55%），提示与疾病有合理关联，但受缺乏正式样本量计算限制；临床效用评分较低（11.34%），因为目前尚无证据表明该生物标志物可改善患者结局或指导临床决策。与工具包中成功和停滞生物标志物基准比较，结直肠癌基准的AV、CV、CU分别为40.75%、52.45%、50.28%，乳腺癌基准分别为46.58%、42.28%、61.74%。

3.5 DNA不足。在81份DNA不足样本中，病例46份、对照35份，分布相对均衡；研究人员未发现DNA不足与年龄、吸烟状态、产次或族裔等流行病学因素存在关联。

讨论部分总结：DNA甲基化检测是宫颈筛查尤其是hrHPV阳性女性分流中日益有前景的策略。WID-CIN指数最初在454例患者中评估，对CIN3⁺的AUC为0.92；本研究在独立队列中发现其总体AUC为0.898，hrHPV阳性女性中为0.875。虽然未直接比较，这一准确性可能高于目前有组织筛查中最常用分流检测细胞学的准确性估计。原始研究中Barrett et al.报告30岁以下女性AUC为0.86、30岁及以上为0.94；本数据中年龄相关准确性下降较不明显，30岁以下AUC为0.857、30岁及以上为0.906，但30岁以下样本量小（n=57）且置信区间重叠，应谨慎解释。研究为病例对照设计，存在固有局限。生物标志物工具包显示WID-CIN作为识别hrHPV阳性女性CIN3⁺风险的诊断生物标志物具有较强潜力；分析有效性高并超过既往成功基准，但未来研究可提供校准曲线、变异系数和详细生物样本处理信息；临床有效性中等并与基准均值相近，主要受缺乏样本量依据限制，未来可加入效能计算和多变量分析；临床效用低，因尚无监管批准、成本效益分析或可行性研究，未来可开展经济学评价、可扩展性和用户可接受性评估。大量生物标志物中极少进入临床实践，验证队列获取受成本和招募时间限制；本研究通过独立研究组合作和数据共享实现，鼓励在线数据共享可能为生物标志物验证提供高效解决方案。Ellis et al.的meta分析纳入125项研究，发现hrHPV阳性人群中PAX1对CIN3⁺具有高准确性；WID-CIN虽包含5000个CpG而非单个CpG，在本hrHPV阳性队列中AUC为0.875，与PAX1相似。PAX1单个CpG甲基化在Bowden and colleagues原始EWAS中独立显著，且PAX1相关CpG包含于WID-CIN指数；额外数千CpG是否显著提高诊断准确性或存在大量冗余尚不清楚。若WID-CIN要成为可扩展检测，转为基于PCR的检测可能有助于规模和成本效益，以与基于较少CpG的更简单检测竞争。WID-qCIN是基于DPP6、RALYL和GSX1三个基因的PCR甲基化检测，是少数在真实世界筛查队列中试验的甲基化检测之一，结果有一定前景；在识别“现患”疾病（0—12个月）时，WID-qCIN对CIN3、宫颈原位腺癌和宫颈癌的阳性率分别为82.1%（78/95）、75%（9/12）和90.9%（10/11），但29.3%（115/385）的阴性和CIN1样本也呈阳性；不限于组织病理学时，WID-qCIN对≤CIN1的特异性为76.9%（1534/1996例CIN1和正常样本检测阴性）。与16/18基因分型联合可提高敏感性，但该策略并非所有环境可行，且降低特异性；该研究还评估了“ incident”疾病（13—72个月），结果相似。hrHPV自采样对高级别宫颈病变检测的准确性与临床医生采集样本相当，已在多个筛查项目中主要用于未参加筛查者；但自采样hrHPV阳性女性通常仍需临床医生采集样本进行细胞学或阴道镜检查，因此当前自采样路径可能只是推迟而非消除筛查障碍。DNA甲基化已在hrHPV阳性自采样中显示可行，若诊断准确性足以替代细胞学作为分流检测，可能提供解决方案；PAX1和SOX1等甲基化标志物在自采样与医生采集样本中显示相当准确性，但WID-CIN指数在自采样中的准确性尚未评估，稳健评估其在该情境中的性能将改善其用于国家筛查项目的证据。研究局限包括病例对照设计可能高估检测准确性，纳入CIN2病例时性能可能降低，尽管CIN2异质且许多可能无需治疗；更大样本量有助于更稳健的亚组分析；缺乏随访数据，无法验证WID-CIN作为预测标志物；鉴于hrHPV检测高敏感性，预测 incident 高级别CIN的甲基化检测可能不如高准确性分流标志物有临床价值；未来前瞻性试验，最好在真实筛查队列中直接比较WID-CIN等甲基化检测与细胞学作为分流检测，将提供更多可转化性信息。

研究结论翻译：WID-CIN指数似乎是一种极具前景的转化生物标志物，可能作为hrHPV阳性女性的有效分流检测。然而，需要大型前瞻性研究充分探索其诊断潜力，尤其是在筛查和分流环境中。成本效益尚未评估。在线数据共享和合作可能为已识别生物标志物的验证提供解决方案，尤其是在生物标志物大量产生的时代。未来甲基化检测研究应旨在预期未来应用环境中试验这些检测，最好在真实世界筛查队列中，作为分流标志物或用于自采样样本。