从副产物到资源：农业厌氧消化液、CO2与合成气耦合生物转化为高附加值微生物蛋白

《Journal of Water Process Engineering》：From by-products to resources: Bioconversion of agricultural digestate, carbon dioxide and syngas into value-added microbial protein

　　

• C. necator 将消化液和 CO₂ 资源化转化为生物量，蛋白质含量达 75 ± 3%。
• H. schlegelii 将消化液和合成气（syngas）资源化转化为生物量，蛋白质含量达 72 ± 6%。
• 首个利用液态消化液（liquid digestate）的嗜热合成气制蛋白平台。
• 微生物群落分析表明嗜热培养物具有高选择性。
• 微生物蛋白的氨基酸谱（amino acid profiles）与豆粕（soybean meal）和鱼粉（fishmeal）相当。

研究背景方面，论文指出到2050年全球人口将达95亿，食品保障与可持续性挑战加剧；全球蛋白需求增长推动畜牧生产和大豆种植扩张，同时增加农业废弃物并带来环境与经济负担。单细胞蛋白（Single-Cell Proteins, SCP；由细菌、酵母、真菌和藻类等微生物产生的蛋白富集生物质）被视为传统蛋白来源的可持续替代品，具有较高氮利用效率、节地、不依赖毁林和无动物福利问题等优势。已有SCP研究多集中于依赖乙醇、糖等化石基原料的酵母、真菌或藻类发酵；近期研究转向废弃原料，包括富糖废水和奶酪乳清用于异养酵母SCP，以及沼气、甲烷用于自养细菌SCP。但沼气和生物甲烷常作为能源和热源，转用于SCP存在资源效率顾虑；利用生物源或工业CO₂富集废气主要采用微藻和光养细菌，但通常需要大量土地，人工光照和封闭光生物反应器带来高资本与运行成本。氢氧化细菌（Hydrogen Oxidizing Bacteria, HOB；可利用H₂作为能源的细菌）作为不依赖光照和土地的CO₂发酵SCP平台受到关注；固体废物气化产生的合成气（syngas；通常由H₂、CO、CO₂和CH₄组成）也被研究用于HOB基SCP，但以往多将CO视为生长抑制剂而非碳和能源，CO直接资源化用于SCP仍研究不足。氮可从废物流回收并用于微生物蛋白生产，Pelagalli et al. (2024)估计经合成气流回收的气态氨可潜在供应HOB微生物蛋白生产50–100%的氮需求；但选择性氮回收未利用残余物流中广泛的微量与宏量营养。厌氧消化（Anaerobic Digestion, AD；有机废物产沼气并稳定化的过程）产生沼气和消化液，后者通常分为可气化产合成气的固相和可作为低成本氮、磷、微量元素及营养辅因子来源的液相；但液态消化液直接用于微生物蛋白存在残留微生物、病原体、重金属、抗菌残留等安全性顾虑，需要适宜预处理和培养策略。消化液气化产生的合成气可燃烧部分满足热化学过程能量需求，也可作为发酵底物将废物碳回收到更高价值产品；AD、热化学转化和气体发酵整合的“full-gas”生物炼制概念已被提出，但AD衍生营养流与沼气提纯及消化液气化来源气体底物整合用于SCP的可行性仍不足。为此，研究人员以预处理液态消化液（pre-treated liquid digestate, PT-LD）为营养源，以代表绿H₂与AD沼气提纯生物CO₂的H₂/CO₂混合气、以及代表消化液固相气化的合成气为碳和能源，研究嗜热菌 Hydrogenibacillus schlegelii（H. schlegelii）、常温菌 Cupriavidus necator（C. necator）两株好氧HOB纯菌及厌氧微生物群落的培养，并评估病原出现、重金属浓度和微生物群落组成等安全相关参数。研究得出PT-LD可支持微生物生长和蛋白生产，C. necator在H₂/CO₂下生物量蛋白含量达75 ± 3%，H. schlegelii在合成气下达72 ± 6%；构建了首个利用液态消化液的嗜热合成气制蛋白平台；微生物群落分析显示嗜热培养物高选择性；微生物蛋白氨基酸谱与豆粕和鱼粉相当。其意义在于将AD液态与气态副产物同时升级为微生物蛋白，把AD从产能技术拓展为整合资源回收生物炼制，并为其饲料应用的安全与监管准备提供初步依据。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究设置两个试验系列（TS）。TS1用铵矿物盐（AMS）培养基和定义厌氧培养基，在气密反应器中以H₂/CO₂或合成气培养三平台并作三重复，监测OD₆₀₀、总悬浮固体、蛋白、气体、挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）和氨基酸，并进行16S-V4-V5扩增子分析。TS2用PT-LD，在2.1 L气密反应器中装250 mL，培养两株纯菌，半连续进行五轮气体置换；采用气相色谱-热导检测器分析气体，BCA法测蛋白，氨基酸分析仪测氨基酸谱，检测Salmonella spp.、Escherichia coli、Listeria monocytogenes、Campylobacter spp.和Clostridium perfringens，ICP-MS测金属，16S-V4-V5分析群落。样本来源为意大利北部全规模1 MW_el中温农业沼气厂液态消化液，主要原料为牛粪和能源作物及少量食品工业副产物；厌氧群落来自市政污水处理厂AD混合菌群并经合成气三周期富集。

研究结果如下。3.1 TS1：微生物平台筛选（在合成液体培养基中生长）。3.1.1 生物量与SCP生产：通过AMS合成培养基三重复比较，所有测试平台均生长；H. schlegelii倍增时间分别为9 ± 3 h和7 ± 1 h、滞后期<24 h，为所有平台中最短；C. necator在H₂/CO₂下倍增时间15 ± 2 h、滞后期约48 h，在合成气下为30 ± 0.1 h和约72 h；厌氧群落动力学显著更慢，倍增时间为纯菌的3–4倍，滞后期分别约96 h和192 h。H. schlegelii在TS1.1最终生物量显著低于C. necator，但两者蛋白含量相近（58 ± 2%与63 ± 4%）；TS1.2中H. schlegelii生物量和蛋白浓度分别为240 ± 10和121 ± 21 mg·L^?1，蛋白含量59 ± 0.1%，C. necator生物量降至142 ± 5 mg·L^?1而蛋白含量65 ± 6%。厌氧群落在TS1.1和TS1.2产乙酸分别为0.22 ± 0.04和0.53 ± 0.33 g·L^?1，显著低于专用产乙酸培养物，归因于产甲烷古菌共存；其高蛋白值不能仅归因于微生物生物量，因接种物来自经合成气预适应的污水污泥AD混合菌群，残余未降解颗粒和细胞碎片会贡献总悬浮固体。结论是纯菌表现更优，厌氧群落不进入TS2。3.1.2 气体转化：TS1.1中H. schlegelii在72 h去除39 ± 3% CO₂和86 ± 0.4% H₂，C. necator在120 h去除35 ± 1% CO₂和90 ± 2% H₂；厌氧群落在120 h消耗55 ± 3% CO₂和90 ± 1% H₂，并产生CH₄至气相10%，支持产甲烷共存。TS1.2中C. necator在120 h仅去除16 ± 3% CO₂和67 ± 4% H₂，可能与CO抑制有关；H. schlegelii在96 h消耗37 ± 1% CO并产生21 ± 1% CO₂、消耗76 ± 3% H₂，符合其一氧化碳营养特性；厌氧群落72 h消耗22 ± 4% CO₂、96 h消耗21 ± 2% CO、192 h消耗49 ± 2% H₂，碳部分转向CH₄。结论是C. necator和H. schlegelii对生物量和蛋白目标具较高生物转化效率，而厌氧群落主要转向产甲烷，限制产乙酸及两阶段SCP潜力。

3.2 TS2：以PT-LD为营养源的半连续气体发酵。3.2.1 消化液特征：通过LD与PT-LD表征及安全性检测，As、Cd、Pb均远低于限值；FeCl₃预处理后金属浓度增加但低于限值，检测到包括与H. schlegelii CO代谢相关的Mo等必需微量元素；LD中多数病原低于检测限，但C. perfringens为10 CFU·g^?1，预处理后不可检出。结论是混凝-微滤改善消化液微生物质量，但这些结果不能确立所得生物质用于食品和饲料的安全性。3.2.2 生物量与SCP生产：通过由AMS转为PT-LD并提高气液比，最终生物量和蛋白浓度提高，但滞后期和倍增时间延长；TS2.1中C. necator倍增时间较TS1.1约翻倍、滞后期不变，生物量净产858 mg·L^?1，约为TS1的近4倍，SCP净产707 mg·L^?1，为TS1.1的5倍；H. schlegelii滞后期和倍增时间中度增加但总体快于C. necator，TS2.1生物量翻倍、SCP积累增4倍。TS2.2中两株倍增时间显著增加，C. necator由30 ± 0.1 h增至180 ± 0.1 h，可能除CO抑制外还有消化液抑制因素；两株生物量积累因能量和碳源增加而提高，PT-LD残余有机碳也可能贡献，尤其对混养型C. necator。H. schlegelii净生物量444 mg·L^?1，低于C. necator，可能与其生长得率较低有关。最高蛋白含量为TS2.1 C. necator 75 ± 3%、H. schlegelii 71 ± 2%；TS2.2 H. schlegelii 72 ± 6%、C. necator 52 ± 1%；多数菌株与气体组合中PT-LD蛋白含量高于AMS。扩增子分析显示H. schlegelii培养物中Hydrogenibacillus占100%，C. necator培养物中C. necator占TS2.1 94 ± 0.03%、TS2.2 89 ± 0.05%，其余主要归为Paracoccus、Stenotrophomonas、Brevundimonas和Alcaligenes，表明嗜热条件高选择性。与文献比较显示本研究蛋白含量高于既往纯培养，与HOB和甲烷氧化细菌混合菌群相当，同时具纯培养操作和监管审批较简单优势；但比较仅为指示性基准。氨基酸方面，H. schlegelii TS2.2必需氨基酸（essential amino acids, EAA）最高，包括赖氨酸4.1 ± 0.1%、亮氨酸5.5 ± 0.1%、苏氨酸3.9 ± 0.1%、苯丙氨酸+酪氨酸7.3 ± 0.1%；C. necator TS2.1 EAA可与传统饲料相比（赖氨酸3.9 ± 0.2%、异亮氨酸2.2 ± 0.3%），TS2.2较低（赖氨酸3.7 ± 0.4%、缬氨酸3.0 ± 0.2%）；非必需氨基酸丰富，谷氨酸达8.7%，丙氨酸在H. schlegelii TS2.2达6.8%；总体EAA与混合HOB相当，H. schlegelii（TS2.1和TS2.2）与C. necator（TS1.2）组成最平衡。3.2.3 气体转化：通过TS2气体监测，TS2.1 C. necator随轮次气体吸收增强，CO₂最大吸收速率0.078 ± 0.006 mmol·h^?1，高于前72 h的0.024 ± 0.002 mmol·h^?1，H₂吸收速率由0.158 ± 0.006升至0.93 ± 0.02 mmol·h^?1；TS2.2 C. necator初始出现轻微净CO₂产生且无显著H₂或CO消耗，随后缓慢耗H₂但无净CO₂下降，H₂氧化可能主要供能而非全部耦联自养固碳，无显著CO消耗符合野生型不能利用CO及CO抑制，最大H₂吸收速率降至0.09 mmol·h^?1。H. schlegelii TS2.1 H₂吸收速率由0.27 ± 0.02升至0.79 ± 0.11 mmol·h^?1，CO₂吸收速率最高约0.038 mmol·h^?1，中间周期CO₂吸收在周期后段更快而H₂相反，提示H₂氧化与卡尔文-本森-巴沙姆循环固碳部分解耦；TS2.2 H. schlegelii H₂吸收速率0.45–0.65 mmol·h^?1，CO吸收速率0.13–0.26 mmol·h^?1，H₂优先消耗，H₂降低后CO消耗增强并伴随净CO₂产生，符合好氧一氧化碳营养，H₂是更有利电子供体。3.2.4 微生物生长化学计量：通过气体质量平衡，C. necator TS2.1得到化学计量式并计算Y_X/H2=0.12 gTSS·gCOD-H₂^?1，接近文献化学计量；TS2.2因可利用PT-LD有机碳的混养代谢，需进一步有机质平衡。H. schlegelii TS2.1得Y_X/H2=0.071 gTSS·gCOD-H₂^?1，约为C. necator一半，与较低生物量积累一致；TS2.2基于气体消耗的表观Y_X/H2=0.9 gTSS·gCOD-H₂^?1高估实际效率，因CO同时作为电子供体，纳入H₂和CO的COD当量后Y_X/(H2+CO)=0.052 gTSS·gCOD^?1，仅略低于H₂/CO₂下的0.071，显示H. schlegelii对合成气组分的代谢灵活性及核算全部电子供体的重要性。

讨论部分总结：AD作为可再生能源生产和有机废物稳定化技术日益受重视，其长期可持续性将越来越依赖所有过程产物的高效增值而非仅沼气生产。本研究证明AD平台产生的液态和气态副产物可同时升级为微生物蛋白，将AD从产能技术拓展为整合资源回收生物炼制；与以往分别研究气体底物或营养回收不同，本研究在同一过程中结合PT-LD与H₂/CO₂及合成气两类废物衍生气体原料，提高AD系统循环性和资源效率，并针对气体发酵SCP依赖合成矿物营养的局限，以消化液衍生营养替代外部化学品。PT-LD可支持生长和蛋白积累，但本概念验证未建立完整N、P回收平衡，且预处理后需外加磷，营养保留是后续过程整合目标。消化液经适当预处理后可作为气体发酵中有价值营养源，蛋白含量高达C. necator 75%、H. schlegelii 72%，优于既往纯HOB培养并接近混合培养性能，同时保留纯培养过程控制和产品一致性优势。监管方面，消化液直接用于饲料和食品仍受微生物和化学安全顾虑限制；混凝-微滤降低微生物风险，重金属低于Directive 2002/32/EC对饲料中不良物质的限值，但欧洲法规尚无消化液衍生培养介质的协调框架，未来需评估药物、抗生素和持久性有机污染物等新出现污染物，并明确消化液衍生底物在循环生物经济中的监管分类；本研究是监管准备的重要一步而非完全立法合规的确定性证据。平台比较表明，H₂/CO₂下C. necator生物量和蛋白生产力最高，适合中温氢基SCP；合成气下H. schlegelii因可直接代谢CO并维持高蛋白含量而表现更好；嗜热培养显示高微生物选择性并降低污染风险，两者应视为互补平台而非竞争替代。合成气混合物是概念验证限制，真实消化液衍生合成气可能含抑制微生物的痕量污染物和气化副产物，需气体净化；实验室H₂与空气预混在放大时需安全措施，应考虑H₂和O₂分开或受控供给。厌氧混合群落虽稳健且可减少灭菌需求，但在本条件下碳转化主要转向产甲烷而非产乙酸，乙酸积累有限，降低基于乙酸的两阶段SCP可行性；其长滞后期和倍增时间降低体积生产力并增加反应器体积需求，抑制产甲烷可提高乙酸但增加过程复杂性，未来多阶段生物炼制可再考虑。实验设计未旨在解析气体转化代谢途径的活动和相对贡献，未来需结合详细气体与代谢物平衡及转录组或蛋白组研究。工程上，消化液化学和氨抑制使生长率低于矿物培养基，氢传质仍是气体发酵主要瓶颈，嗜热培养加热能耗需与抗污染和合成气转化能力平衡，未来应开展长期连续运行并耦合技术经济和生命周期评价。

研究结论部分翻译：本研究证明AD的液态和气态副产物可同时资源化用于微生物蛋白生产，将AD的作用从可再生能源生产拓展至整合资源回收。预处理消化液作为主要废物衍生营养源成功支持微生物生长和蛋白生产，显示其在整合SCP生产过程中的增值潜力。实验结果确定两个互补工艺配置：C. necator更适合H₂/CO₂基培养，而H. schlegelii在嗜热条件下对合成气增值显示更大潜力；两种情况下均以预处理消化液为主要废物衍生营养源成功生产了蛋白丰富且氨基酸谱有利的生物质。除技术可行性外，本研究为将AD衍生气体碳流和消化液衍生营养整合到微生物蛋白生产提供了概念验证。未来研究应使用真实AD衍生气流验证过程，包括评估消化液衍生合成气中的痕量化合物和杂质并实施适当气体净化策略；还应研究避免H₂/空气直接预混的安全供气配置，并开展长期连续运行以评估过程稳定性并支持反应器放大。最后，需开展技术经济和生命周期评价，并进一步评估生物质安全性、营养质量和监管合规性，以支持饲料应用的工业实施。