预处理对辐鳍鱼类牙齿结构碳酸盐同位素组成的影响

《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》：Effects of Pretreatment on the Isotopic Composition of Structural Carbonate in Ray-Finned Fish Teeth

　　

摘要 原理： 鱼类牙齿牙本质中所含碳酸盐的碳、氧稳定同位素比值（δ13C和δ18O）具有揭示环境和生态条件的潜力，使其成为化石标本分析中颇具前景的研究目标。然而，现存标本的牙齿牙本质含有大量有机物，这些有机物可能分解或产生干扰同位素测量的气体。因此，在开展同位素分析之前，建立一套完善的去除有机组分的前处理方案至关重要。 方法： 在本研究中，研究人员开发了去除有机物的前处理方法，以实现对牙本质中结构碳酸盐的同位素分析。以半滑光豚（Lagocephalus spadiceus）的牙齿为标本，研究人员共实施了八种物理和化学前处理方案，并评估了它们对碳酸盐同位素组成的影响。 结果： 中性或碱性胰酶溶液的 treatments 能有效去除有机物，且不改变碳酸盐的δ13C值。相比之下，未找到能完全保持δ18O值不受影响的处理方法。然而，中性胰酶溶液处理能够在充分去除有机物的同时，仅引起δ18O微小且一致的改变。 结论： 对于牙本质内碳酸盐的δ13C分析，推荐使用中性或碱性胰酶溶液处理。尽管未找到在不改变δ18O值的情况下理想去除有机物的方法，但中性胰酶溶液处理被推荐为次优选择。由于δ18O的改变幅度小且一致，因此可以对前处理引起的δ18O变化进行校正。

论文解读

一、研究背景与科学问题

辐鳍鱼类（Actinopterygii）占脊椎动物物种的一半，其栖息地高度多样化，是水生生态系统中最为普遍的类群之一。然而，尽管其化石在沉积物中相对丰富，辐鳍鱼类的演化历史仍 largely 未知。鱼类化石为理解其演化提供了有力线索，其中鱼类牙齿作为小型鱼类化石碎屑的重要组成，在新生代之后的远洋黏土沉积物中较为常见，在海山山脚或海洋台地处的沉积颗粒中有时可占30 vol%。辐鳍鱼牙齿的数量远多于软骨鱼类的鳞片，因此化石牙齿对于理解过去辐鳍鱼类的生态具有重要意义。

牙齿结构碳酸盐的同位素值能够提供包括鱼类在内的脊椎动物的环境、生态和生理信息。在羟基磷灰石的晶体结构中，碳酸根离子取代羟基（OH^?）和磷酸根（PO₄^3?）离子。结构碳酸盐的稳定碳同位素比值（δ¹³C）记录了代谢、营养级和周围水体溶解无机碳的δ¹³C，而稳定氧同位素比值（δ¹⁸O）则记录了周围水体的温度和盐度。尽管这些机制在陆生哺乳动物的现代牙齿中已得到较好阐明，但在鱼类牙齿中尚未得到阐明，尽管鱼类的分类群、栖息地和生态具有多样性。

现代样本是理解同位素分馏和掺入机制的关键，但现代牙齿样本含有相对大量的有机物，尤其是牙本质中。牙本质含有约30 wt.%的有机物和水，而釉质层仅含约4 wt.%。有机物会带来多重问题：湿样本中的有机物促进细菌滋生并产生有机酸，溶解和劣化牙齿样本；有机物可能阻止样本与磷酸反应，而这是获取用于同位素分析的CO₂气体所必需的；软组织中的挥发性有机物会损害气相色谱柱或同位素比值质谱仪的高真空和高电压部件；有机物分解产生的挥发性有机物和CO₂气体可能污染源自结构碳酸盐的CO₂气体，改变分析获得的同位素比值。因此，在进行同位素分析前，需要通过预处理去除有机物。然而，去除有机物时，碳酸盐同位素组成可能因方法不同而发生次生碳酸盐形成导致的变化，且变化程度可能因牙齿微结构元素而异。尽管已有针对釉质层去除有机物而不改变结构碳酸盐同位素组成的方法，但尚未有针对牙本质的此类方法。本研究旨在建立用于牙本质结构碳酸盐同位素分析的有机物去除方法。

二、研究内容与主要结论

研究人员以半滑光豚（Lagocephalus spadiceus）的牙齿为标本，共实施了八种物理和化学预处理方案，评估了它们对碳酸盐同位素组成的影响。研究发现，中性或碱性胰酶溶液处理能有效去除有机物，且不改变碳酸盐的δ¹³C值。然而，没有找到能完全保持δ¹⁸O值不受影响的处理方法。中性胰酶溶液处理能够在充分去除有机物的同时，仅引起δ¹⁸O微小且一致的改变。由于这种改变的可重复性，处理后获得的δ¹⁸O值可以被校正以接近原始δ¹⁸O值。这一研究为辐鳍鱼类牙齿牙本质结构碳酸盐的同位素分析提供了可靠的前处理方法，对利用化石牙齿重建古环境和古生态具有重要意义。

三、关键技术与方法

本研究采用的关键技术方法包括：物理清洗（使用镊子尽可能去除附着肌肉等软组织）；化学预处理，包括有机溶剂固定（99.5%乙醇或99%丙酮浸泡1天）、氧化处理（30% H₂O₂水溶液浸泡1天或2% NaClO水溶液浸泡3天）、碱水解处理（0.1 mol/L NaOH水溶液浸泡1天）以及酶解处理（1%胰酶溶液在中性或碱性条件下40°C处理1天）；稳定同位素比值质谱分析（使用配备Finnigan GasBench II的Delta V Plus质谱仪，以NBS 19、JCp-1和JCt-1为标准物质进行校准）；X射线衍射（XRD）分析（使用RINT-Ultima⁺衍射仪，Cu Kα辐射，40 kV和30 mA）以评估矿物相变化。样本来源于日本爱知县伊势湾捕获的39个半滑光豚个体，共提取牙齿样本152个，椎骨样本123个。

四、研究结果

3.1 处理后鱼牙齿的外观： 物理清洗、乙醇、丙酮和NaOH水溶液处理后，仍有大量有机物（如附着肌肉）残留。而H₂O₂水溶液、NaClO水溶液、中性和碱性胰酶溶液处理后，牙齿和椎骨样本上的所有附着肌肉均被去除。

3.2 碳酸盐含量： 乙醇、丙酮、H₂O₂水溶液或中性胰酶溶液处理对碳酸盐含量（wt.%）无显著影响或变化很小。NaClO水溶液处理显著增加了碳酸盐含量（牙齿ΔCO_3Tooth = +2.97 ± 1.30 wt.%，椎骨ΔCO_3Vert = +8.97 ± 0.72 wt.%），NaOH水溶液处理也显著增加了碳酸盐含量（牙齿+1.15 ± 0.37 wt.%，椎骨+1.68 ± 0.35 wt.%）。碱性胰酶溶液处理在牙齿中未引起显著变化，但在椎骨中显著增加。

3.3 δ¹³C值： 乙醇、丙酮、NaClO水溶液或中性胰酶溶液处理对δ¹³C值无显著影响。H₂O₂水溶液处理显著降低了δ¹³C（牙齿Δ¹³C_Tooth = ?1.15‰ ± 0.91‰，椎骨Δ¹³C_Vert = ?1.28‰ ± 0.18‰），NaOH水溶液处理也显著降低了δ¹³C（牙齿?3.22‰ ± 0.32‰，椎骨?2.06‰ ± 0.51‰）。碱性胰酶溶液处理在牙齿中引起微小变化，在椎骨中显著降低。

3.4 δ¹⁸O值： 乙醇或丙酮处理未显著降低δ¹⁸O。NaOH水溶液处理显著降低了δ¹⁸O（牙齿Δ¹⁸O_Tooth = ?2.32‰ ± 0.42‰，椎骨Δ¹⁸O_Vert = ?4.25‰ ± 1.32‰）。碱性胰酶溶液处理引起中等程度降低（牙齿?1.11‰ ± 0.49‰，椎骨?1.92‰ ± 0.36‰），中性胰酶溶液处理也引起中等程度降低（牙齿?0.95‰ ± 0.29‰，椎骨?0.73‰ ± 0.41‰）。H₂O₂水溶液处理在椎骨中显著降低，在牙齿中变化较小。NaClO水溶液处理在牙齿中显著降低，在椎骨中变化很小。

3.5 XRD图谱： 所有经过化学处理的牙齿样本均表现出与物理清洗样本相似的XRD图谱，衍射峰的位置和相对强度与磷灰石一致。所有图谱中的衍射峰均较宽且大量重叠，无法区分羟基磷灰石和氟磷灰石。在2θ = 26°附近的孤立峰上，未观察到因预处理导致的峰宽差异，表明预处理未引起晶粒尺寸或晶格应变的变化。

五、讨论与结论

讨论部分总结： 物理清洗样本的碳酸盐含量为2.60 ± 0.59 wt.%，低于文献报道的约3.4 wt.%，表明残留有机物产生的CO₂气体足够低，分析所得CO₂气体主要来源于结构碳酸盐，因此物理清洗样本可作为评估后续处理引起同位素变化的合适参考。中性胰酶溶液处理被推荐为分析牙本质结构碳酸盐δ¹³C的合适有机物去除方法，因为它能有效去除所有附着肌肉，同时保持原始δ¹³C值，且XRD图谱显示晶粒尺寸或晶格应变无显著变化。碱性胰酶溶液处理可能因磷酸盐组织内有机物排列的差异而改变结构碳酸盐的δ¹³C。对于δ¹⁸O分析，中性胰酶溶液处理是本研究评估中最有效的方法，尽管它可能引起轻微的δ¹⁸O偏移，但由于偏移量小且一致，可以通过使用物理清洗样本作为参考并持续监测Δ¹⁸O来进行校正。H₂O₂水溶液处理虽能有效去除有机物且δ¹⁸O变化不大，但显著降低了δ¹³C超过1‰，表明其未保持原始δ¹⁸O值。常规预处理方法（如H₂O₂水溶液、NaClO水溶液和NaOH水溶液）会改变结构碳酸盐的同位素组成，因此不适合用于结构碳酸盐的同位素分析。此外，中性胰酶溶液处理略微改变了结构碳酸盐的δ¹⁸O，表明有机物的腐烂过程可能干扰其原始同位素组成，提示化石牙本质中结构碳酸盐的δ¹⁸O可能在早期成岩有机物分解过程中发生改变，应谨慎将其作为环境和生态重建的指标。

研究结论翻译： 研究人员开发了一种从现存辐鳍鱼类牙齿牙本质中去除有机物以进行结构碳酸盐同位素分析的方法。中性或碱性胰酶溶液处理被推荐为在保持结构碳酸盐原始δ¹³C值的同时有效去除有机物的方法。然而，尚未找到在不改变结构碳酸盐δ¹⁸O的情况下去除有机物的方法。中性胰酶溶液处理是首选替代方案，因为其引起的δ¹⁸O变化相对较小且一致。鉴于这种偏移的可重复性，处理后获得的δ¹⁸O值可以被校正以近似原始δ¹⁸O值。